Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pela revisão veterinária do JoVE.
1. Preparação antes da coleta de tecido
- Ajuste a centrífuga para 4 oC.
- Polir um conjunto de três pipetas Pasteur de vidro com diâmetros decrescentes de aproximadamente 1,3, 0,8 e 0,4 mm para cada amostra.
- Prepare os tubos rotulados de 1,7 ml contendo 1 ml de tampão frio A e mantenha os tubos no gelo.
- Prepare uma bandeja de gelo contendo a matriz de corte de cérebro, espátulas e placas de vidro (ou placa de Petri de vidro invertido) para realizar a dissecação. Pré-resfrie duas ou mais lâminas de barbear nas placas de vidro e use lenços de papel para secar todos os instrumentos que tocam o tecido.
- Descongele a solução enzimática à temperatura ambiente (RT) por 30 min antes da coleta do tecido.
2. Coleta e dissecção de tecidos
- Iniciar o tratamento comportamental ou farmacológico 90 min antes da coleta de tecidos.
nota: Para os resultados aqui apresentados, foram realizadas injeções intraperitoneais agudas de 5 mg/kg de metanfetamina em ratos em um novo ambiente (condição de teste) e ratos virgens mantidos em suas gaiolas domésticas (condição de controle).
- Anestesiar o rato colocando-o em um frasco dessecador de vidro com isoflurano saturado e decapitar o rato 30 a 60 segundos depois usando uma guilhotina.
Use uma tesoura para remover a pele e o músculo da cabeça e expor o crânio. Use rongeurs para cortar o crânio, abra o forame magno e remova a parte de trás do crânio. Use rongeurs para cortar ao longo das bordas superiores do crânio para expor o cérebro. Tenha cuidado para não danificar o cérebro. Use uma pequena espátula para escavar suavemente e elevar o cérebro. Levante o cérebro e corte os nervos até que o cérebro esteja livre.
- Disseque o tecido usando lâminas de barbear.
nota: Obter amostras de tecido utilizando um dos seguintes métodos: (2.3.1) tecido recentemente dissecado; (2.3.2) tecido congelado após dissecção; ou (2.3.3) tecido congelado dissecado de todo o cérebro congelado. Mantenha a matriz de corte cerebral, as lâminas de barbear e a placa de vidro secas durante os processos de dissecção e picagem, pois a água condensada pode levar à lise hipotônica das células. Use lupas para garantir uma dissecção precisa.
- Para tecido recém-dissecado, coloque o cérebro recém-extraído em uma matriz de corte de cérebro (um molde de metal em forma de cérebro de rato com ranhuras para as lâminas de barbear em intervalos de 1 mm) que foi resfriado em gelo. Insira duas ou mais lâminas de barbear pré-resfriadas nas ranhuras para cortar fatias coronais que contenham a(s) região(ões) cerebral(is) de interesse. Coloque a fatia cortada na placa de vidro resfriada.
Nota: Disseque as regiões cerebrais de interesse em uma placa de vidro gelada.
- Para o tecido congelado após a dissecação, dissecar a(s) região(ões) cerebral(is) de interesse das fatias de cérebro recém-extraído, semelhante à descrita acima em 2.3.1. Coloque o tecido dissecado em um microtubo e congele rapidamente o tecido submergindo o microtubo em isopentano a -40 ºC por 20 segundos. Manter o tecido dissecado sempre congelado num congelador a -80 ºC até ao processamento posterior.
- Para tecido congelado, congele imediatamente o cérebro recém-extraído em isopentano a -40 ºC e armazene em um saco lacrado a -80 ºC por até 6 meses.
- No dia da dissecção, coloque o cérebro congelado em um criostato ajustado a aproximadamente -20 ºC (não mais quente que -18 ºC) por aproximadamente 2 horas para equilibrar a temperatura.
nota: Os cérebros podem ser cortados facilmente a essa temperatura, enquanto temperaturas muito mais baixas tornam o cérebro muito quebradiço para ser cortado com segurança.
- Use lâminas de barbear para cortar fatias coronais de 1 a 2 mm dos cérebros congelados em um criostato. Em condições de congelamento, use uma agulha embotada de calibre 12 a 16 para obter punções de tecido dessas fatias. Mantenha o tecido dissecado congelado o tempo todo até o processamento posterior.
- Adicione 1 a 2 gotas de tampão A para cobrir o tecido dissecado antes de picar. Remova a maior parte da substância branca do tecido usando duas lâminas de barbear para evitar a perda de neurônios durante o resto do processo de trituração. Se começar com tecido congelado, deixe o tecido descongelar na placa de vidro frio por não mais de 1 minuto antes de aplicar a solução de tampão A.
- Pique o tecido 100 vezes em cada direção ortogonal com uma lâmina de barbear em uma placa de vidro gelada. Segure a lâmina de barbear verticalmente na placa de vidro ao picar.
nota: A picagem completa é fundamental para todas as etapas do protocolo.
- Use lâminas de barbear para transferir o tecido picado para tubos de microcentrífuga contendo 1 ml de tampão frio A. Inverta o tubo 3 a 5 vezes para manter todo o tecido picado na solução.
3. Dissociação Celular
NOTA: Use uma mistura suave de ponta a ponta para todas as etapas a seguir. Não use um misturador de vórtice e evite bolhas de ar que causem danos às células.
- Centrifugar os tubos de recolha a 110 x g durante 2 min a 4 ° C. Rejeitar o sobrenadante. Adicione lentamente 1 ml de solução enzimática fria e recém-descongelada (contendo uma mistura de enzimas proteolíticas) pela parede interna do microtubo. Sugue imediatamente todo o pellet e pipete suavemente para cima e para baixo apenas 4 vezes com uma pipeta de diâmetro de ponta moderadamente grande para dispersar o pellet de tecido picado.
- Inverter os microtubos imediatamente para evitar que o pellet grude no fundo e incubar as amostras com mistura ponta a ponta por 30 min a 4 oC.
- Após a digestão enzimática do tecido, centrifugue os tubos a 960 x g por 2 min a 4 ºC. Remova o sobrenadante e adicione 0,6 ml de tampão A frio. Imediatamente após a adição do tampão A, use a mesma ponta de pipeta para dispersar o pellet sugando todo o pellet e pipete suavemente para cima e para baixo 5 vezes.
- Triturar mecanicamente o tecido digerido e recolhê-lo em tubos de 15 ml utilizando os seguintes passos. Para cada amostra, use um conjunto separado de 3 pipetas Pasteur de vidro polido a fogo com diâmetros decrescentes de aproximadamente 1,3, 0,8 e 0,4 mm presos a lâmpadas de látex.
- Triturar suavemente cada amostra 10 vezes com a pipeta de vidro de 1,3 mm. Deixe a amostra repousar por 2 min no gelo (os detritos e as células não dissociadas se depositarão no fundo). Colete o sobrenadante (~ 0,6 ml) e transfira-o para um tubo cônico de 15 ml (tubo # 1).
- Adicione 0,6 ml de solução tampão A ao grânulo restante. Triturar a amostra 10 vezes com a pipeta de vidro de 0,8 mm. Deixe a amostra repousar durante 2 min no gelo. Colete o sobrenadante (~ 0,6 ml) e transfira-o para o mesmo tubo cônico de 15 ml #1.
- Adicione 0,6 ml de solução tampão A ao grânulo restante. Triturar a amostra 10 vezes com a pipeta de vidro de 0,4 mm. Deixe a amostra repousar durante 2 min no gelo. Colete o sobrenadante (~ 0,6 ml; sem tocar no pellet com células não dissociadas) e transfira para o mesmo tubo cônico de 15 ml # 1.
nota: Mantenha a pipeta de 0.4 mm de diâmetro no tubo #1 para as etapas de trituração seguintes.
- Repita a etapa 3.4.3 mais três vezes usando a pipeta de vidro menor (~ 0,4 mm de diâmetro) e colete o sobrenadante em um tubo cônico separado de 15 ml (tubo # 2).
- Triturar as suspensões celulares coletadas nos tubos #1 e #2 por mais 10 vezes usando a pipeta de vidro de 0,4 mm e mantê-las no gelo.
4. Fixação e permeabilização celular
- Prepare 4 microtubos por amostra (dois microtubos para células do tubo # 1 e dois para células do tubo # 2) adicionando 800 μl de etanol 100% frio (armazenado a -20 oC antes do uso) em cada tubo e mantenha-os no gelo. Nota: A concentração final de etanol será de 50%.
- Pipete ~ 800 μl das suspensões celulares (do tubo # 1 e tubo # 2) em cada um dos 4 tubos contendo etanol frio e inverta os tubos para misturar as amostras.
- Incube os tubos no gelo por 15 minutos enquanto inverte os tubos a cada 5 minutos.
- Após fixação/permeabilização, centrifugar os tubos a 1.700 x g por 4 min a 4 ºC e descartar o sobrenadante. Deixe 50 μl de solução para evitar a perda de células.
nota: Os pellets nesta fase são brancos e aderem menos à parede dos tubos do que antes da permeabilização. Portanto, remova o sobrenadante cuidadosamente tocando a parede do microtubo onde não há pellet e retire o sobrenadante lentamente usando uma micropipeta.
5. Filtração Celular
- Ressuspenda os pellets da etapa 4.4 com PBS frio da seguinte forma:
- Adicione 550 μl de PBS frio a um dos dois microtubos provenientes do tubo # 1 e use uma ponta de pipeta de diâmetro moderadamente grande para pipetar suavemente a suspensão celular para cima e para baixo 5 vezes. Repita o mesmo para um microtubo proveniente do tubo #2.
- Para células do tubo #1, usando a mesma pipeta, transfira a suspensão da primeira célula para o segundo pellet. Ressuspenda o segundo pellet pipetando suavemente a suspensão de célula combinada para cima e para baixo 5 vezes.
- Para as células do tubo #2, ressuspender e combinar os pellets (isto é, terceiro e quarto microtubos) como descrito em 5.1.2.
