Avaliando o estado de palmitoilação de proteínas da membrana celular do tecido cerebral de camundongos

Resumo

Fonte: Speca, D. J., et al. Ensaio de deslocamento em gel de troca acil-PEGil para determinação quantitativa da palmitoilação de proteínas da membrana cerebral. J. Vis. Exp. (2020).

O vídeo demonstra a análise do estado de palmitoilação de proteínas da membrana celular isoladas do tecido cerebral de camundongos. O processo envolve expor as cisteínas não palmitoiladas e bloqueá-las, usando um polímero que se liga às cisteínas palmitoiladas, auxiliando na avaliação do estado de palmitoilação das proteínas isoladas.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Preparação de membranas cerebrais de camundongos

1. Decapite o camundongo usando um aparelho de guilhotina e disseque o cérebro rapidamente (em <1 min, se possível, para minimizar as alterações de palmitoilação que podem ocorrer durante o procedimento de dissecação). Homogeneizar imediatamente em 10 mL de tampão de homogeneização (Tabela 1) em um homogeneizador de vidro (~ 12 tempos) em gelo.
2. Centrifugar lisados durante 15 min a 1 400 x g a 4 °C. Transferir o sobrenadante para um novo tubo sobre gelo. Ressuspenda o pellet (~ 6 cursos) em um volume igual de tampão de homogeneização e centrifugue a 710 x g por 10 min a 4 ° C.
3. Combinar os sobrenadantes do passo 1.2 e centrifugar a 40.000 x g durante 20 min a 4 °C.
4. Rejeitar o sobrenadante (fracção citosólica) e ressuspender a fracção da membrana peletizada (P2) em tampão de homogeneização.
   nota: As amostras podem ser congeladas rapidamente e armazenadas a -80 °C para uso posterior.
5. Realize um ensaio de ácido bicinconínico (BCA) para quantificar os níveis de proteína. Para o ensaio de troca de gel-shift acil-PEGil (APEGS), comece com ~ 100-200 mg de proteína (máximo de 250 mg) em um volume de 470 μL de tampão A (Tabela 1) em um tubo de 1,5 mL. Sonicar e centrifugar a >13.000 x g durante 10 min a 25 °C para remover a proteína insolúvel. Transfira a proteína solubilizada para um novo tubo de 1,5 mL.

2. Ensaio de troca de acil-PEGil gel-shift (APEGS)

1. Interrompa as ligações dissulfeto e bloqueie as cisteínas livres.
   1. Romper as ligações dissulfeto incubando em 25 mM de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP; 25 μL, adicionada de uma solução reserva; Tabela 1) por 60 min a 55 °C.
   2. Cisteínas livres de bloco com 50 mM de N-etilmaleimida (NEM; 12,5 μL, adicionada de uma solução estoque; Tabela 1) à temperatura ambiente por 3 h.
      nota: A reação pode ser estendida durante a noite.
2. Realize a precipitação de clorofórmio metanol (CM).
   1. Transfira a solução de proteína de um tubo de 1,5 mL para um tubo de polipropileno ou vidro que possa ser centrifugado em um rotor de balde oscilante a uma velocidade modesta. Um tubo de 5 mL é o ideal. Adicione quatro volumes (2 mL) de metanol (MeOH) e vórtice brevemente.
   2. Adicione dois volumes (1 mL) de clorofórmio e vórtice brevemente.
   3. Adicione três volumes (1,5 mL) de água deionizada (dH₂O) e vortex brevemente.
   4. Centrifugue as amostras a 3.000 x g por 30 min a 25 °C em um rotor de caçamba oscilante.
   5. Remova e descarte cuidadosamente a fase superior.
   6. Adicione 3 volumes (1,5 mL) de MeOH e misture delicadamente, mas bem, tomando cuidado para não fragmentar a panqueca de proteína opaca.
   7. Centrifugue a 3.000 x g por 10 min a 25 °C em um rotor de caçamba oscilante.
   8. Usando uma pipeta sorológica de vidro, remova o máximo possível da fase superior sem perturbar a panqueca de proteína.
   9. Enxágue cuidadosamente o pellet com 1 mL de MeOH.
   10. Seque o pellet ao ar por pelo menos 10 min.
       nota: O pellet seco pode ser armazenado a -20 °C.
3. Realize a clivagem das ligações palmitoil-tioéster com hidroxilamina (NH₂OH, HAM).
   1. Ressuspenda o precipitado de proteína em 125 μL de tampão A e sonice brevemente. Centrifugue a >13.000 x g por 10 min a 25 °C para remover o material insolúvel. Transfira a proteína solubilizada para um novo tubo de 1,5 mL.
   2. Adicione 375 μL de tampão H (HAM+; Tabela 1) ou tampão T (HAM-; Tabela 1) e incubar amostras por 60 min a 25 °C.
4. Repita a precipitação CM descrita na etapa 2.2.
   nota: O pellet seco pode ser armazenado a -20 °C.
5. Adicione mPEG a cisteínas desprotegidas.
   1. Ressuspenda o pellet em 100 μL de tampão A contendo 10 mM TCEP. Transferir para um tubo de 1,5 mL.
      nota: É normal que tenha ocorrido perda significativa de proteína durante as etapas de precipitação do CM. Todas as etapas subsequentes serão realizadas em um tubo de 1,5 mL, restringindo o volume de proteína a um máximo de ~ 120−130 μL. Isso reduzirá a perda de proteína durante a precipitação final do CM.
   2. Adicionar 20 mM mPEG-5k (25 μL, adicionados de uma solução reserva; Tabela 1) para amostra de proteína e mistura por pipetagem. Incubar durante 60 min a 25 °C com rotação de ponta a ponta.
   3. Para remover o mPEG-5k não incorporado, execute a precipitação de CM conforme descrito na etapa 2.2 usando estes volumes ajustados: 4 volumes de MeOH (500 μL), 2 volumes de clorofórmio (250 μL) e 3 volumes de dH₂O (375 μL). Centrifugue a >13.000 x g por 10 min a 25 °C.
   4. Remova cuidadosamente a fase superior como antes, evitando a panqueca espessa e floculenta. Adicione 1 mL de MeOH e misture delicadamente, mas completamente. Centrifugue a >13.000 x g por 10 min a 25 °C.
   5. Remova cuidadosamente o sobrenadante e enxágue o pellet com 1 mL de MeOH. Centrifugue a >13.000 x g por 10 min a 25 °C. Pellet seco ao ar.
      >nota: O pellet seco pode ser armazenado a -20 °C.
   6. Ressuspenda o pellet seco em 50 μL de tampão A (sem TCEP ou qualquer agente redutor).

Resultados

Tabela 1: Soluções usadas para o ensaio APEGS. O tampão de homogeneização e o tampão A podem ser preparados com antecedência; no entanto, adicione inibidores de protease e fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF) imediatamente antes de usar. Todas as outras soluções devem ser preparadas frescas.

Buffer

Componentes

<...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Hidroxilamina (HAM)	ThermoFisher	26103
Metoxi-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG)	NOF	ME-050MA	MW ~5000 kDa
Microfuga	Eppendorf	5415R	ou equipamento equivalente
N-etilmalemida (NEM)	Calbiochem	34115	Altamente tóxico
Gerador de imagens ópticas para densitometria	Azure Biosystems	Imageador Biomolecular de Safira	ou equipamento equivalente
Tubos de polipropileno com tampa	Fisher Scientific	14-956-1D
Pipetas serológicas (vidro)	Fisher Scientific	13-678-27D
Centrífuga de mesa	Beckman	Allegra X-15R	ou equipamento equivalente
Cloridrato de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP)	EMD Millipore	580560