Fabricação de microesferas de polímero liberador de beta-amilóide para modelagem da doença de Alzheimer

Resumo

Fonte: Almari, B., et al. Fabricação de microesferas de alginato secretoras de β amilóide para uso na modelagem da doença de Alzheimer. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo demonstra um método para fabricar microesferas de polímero que encapsulam células secretoras de beta-amilóide neurotóxicas. A suspensão célula-polímero é processada por meio de um dispositivo de fabricação de microesferas, com gelificação de polímero obtida por meio de reticulação de cálcio, formando microesferas esféricas ao redor das células. O polímero permite a proliferação celular enquanto permite a liberação controlada e de longo prazo de beta-amilóide, simulando seu acúmulo na doença de Alzheimer.

Protocolo

1. Preparativos

1. Prepare 100 mL de solução estoque de alginato de ~ 4% (p / v).
   1. Pese 4,4 g de sal de alginato de sódio e adicione o pó seco a 100 mL de solução salina tamponada com HEPES (HBS, ácido sulfônico etano etano 20 mM [HEPES] (0,477 g) com 150 mM de NaCl (0,877 g) em água deionizada permitindo a hidratação.
   2. Use um agitador magnético a ~500 rotações por minuto (rpm) e aqueça até 50 °C para permitir a hidratação completa do alginato.
      nota: O alginato pode precisar de uma ou duas horas para ser completamente hidratado. Para poupar tempo, a solução de alginato pode ser preparada um dia antes do protocolo de encapsulação e conservada a 4 °C até ao dia seguinte. Quando o alginato tiver sido refrigerado, aquecer suavemente a 37 °C em banho-maria ou numa placa quente e agitar com um agitador magnético imediatamente antes da utilização.
   3. Filtrar a solução de alginato com um filtro de polietersulfona (PES) de poros de 0,22 μm antes da utilização. Recomenda-se a filtragem a 37 °C para permitir um fluxo fácil de alginato. A viscosidade aumentará se a temperatura cair.
2. Prepare 1.000 mL de CaCl_{0,5 M 2}.
   1. Pesar 55,49 g de CaCl₂ anidro e dissolver em 1.000 mL de HBS (20 mM HEPES e 150 mM NaCl em 1.000 mL de água deionizada).
   2. Filtro estéril usando um filtro PES de poros de 0,22 μm.
3. Prepare 100 mL de mistura de dissolução.
   1. Prepare uma solução de HEPES 100 mM (23,83 g) e citrato trissódico di-hidratado 500 mM (147,05 g) em solução salina tamponada com fosfato.
   2. Ajuste para pH 7,4 usando NaOH ou HCl.

2. Configurando o sistema de encapsulamento

1. Limpe a coifa de fluxo laminar.
   1. Esterilize a capela de fluxo laminar contendo o encapsulador usando exposição UV seguida de pulverização com solução de etanol a 70% v / v.
   2. Lave o sistema encapsulador com 10 mL de solução de etanol a 70% v/v seguido de 10 mL de água deionizada estéril.
   3. Conecte o bico de 300 μm e repita a etapa 2.1.2.
   4. Pulverize o frasco contendo a solução de alginato filtrado, o frasco contendo a solução filtrada de cloreto de cálcio e quaisquer ferramentas, equipamentos e placas de cultura vazias que serão usados com solução de etanol a 70% v/v e coloque-os na capela de fluxo laminar. Antes de usar, acenda uma luz ultravioleta novamente por 30 minutos para esterilizar completamente.
   5. Prepare um copo de resíduos cheio de uma solução desinfetante de grau biológico e coloque o copo no exaustor.
   6. Encher um copo com 100 ml de solução estéril de CaCl₂ (aquosa) e adicionar um agitador magnético. Defina a velocidade de agitação para 100 rpm. Colocar o copo sobre uma plataforma magnética a uma altura de 18 cm da ponta do bico. Este copo será usado para coletar contas de alginato e permitir sua gelificação.
2. Prepare as células para encapsulamento.
   1. Remova as células da incubadora e desprenda do frasco quase confluente usando solução de ácido tripsina-etilenodiaminotetracético (EDTA) a 0,25% e incube a 37 ° C por 5-10 min.
   2. Isole uma amostra para estimativa da densidade celular e, em seguida, centrifugue as células restantes a 1.000 rpm por 5 min para obter um pellet celular.
   3. Ressuspenda o pellet em HBS (20 mM HEPES e 150 mM NaCl) para dobrar a concentração celular final desejada (por exemplo, para uma concentração final de 1,5 x 10⁶ células/mL, ressuspenda as células em HBS para atingir uma concentração de 3 x 10⁶ células/mL).
   4. Em um tubo de centrífuga de 50 mL, misture a suspensão celular na proporção de 1:1 com solução de alginato de ~4% (p/v) para obter uma suspensão final contendo a concentração celular desejada (por exemplo,., 1,5 x 10⁶ células/mL) em uma solução de alginato de ~2% (p/v).
3. Defina os parâmetros de encapsulamento.
   1. Defina a velocidade da máquina encapsuladora para a velocidade máxima de extrusão (8,9 mL/min), a tensão para 1,0 kV e a frequência para 5.500 Hz.
      nota: Esses parâmetros foram previamente otimizados para obter microesferas de 550 μm de diâmetro.

3. Fabricação

1. Fabricar as microesferas.
   1. Em uma seringa de 20 mL, carregue 5 mL da suspensão de alginato de células e conecte uma seringa ao encapsulador.
   2. Inicie o encapsulador ativando o fluxo que empurrará a suspensão de alginato celular através do alimentador. Um fluxo de gotículas será extrudado através do bico.
   3. Recolha o primeiro 1 ml no copo de resíduos para evitar o fluxo inicial não uniforme.
   4. Continue a executar os 4 mL restantes, permitindo que as gotículas caiam no banho de gelificação de CaCl₂. Cada mililitro pode ser executado separadamente (mas sucessivamente) e coletado em quatro banhos de gelificação diferentes, se necessário.
      nota: Ao entrar em contato com o banho de gelificação, o alginato nas gotículas se reticulará instantaneamente com os íons de cálcio no banho de gelificação e formará microesferas esféricas.
   5. Após um minuto, remova o copo de gelificação da plataforma magnética e deixe as microesferas descansarem por mais 4 min sem agitação (tempo necessário para permitir a gelificação completa nas microesferas à temperatura ambiente).
2. Recupere microesferas.
   1. Remova quaisquer detritos ou artefatos grandes de alginato usando uma pinça estéril e, em seguida, use uma pipeta de plástico estéril para transferir para um filtro de malha de 74 μm para recuperar as microesferas do banho de gelificação.
   2. Transferir as microesferas para um tubo de centrifugação utilizando o meio de cultura adequado e deixá-las equilibrar durante 5 minutos no meio de cultura celular.
   3. Transferir para um frasco, placa ou placa de Petri para incubação e outros experimentos.
      nota: O banho de gelificação não deve ser reutilizado.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0.22 um filtro PES	Merck, Reino Unido	SLGP033RS
15mm Netwell inserir filtro de malha de 74 um	Constar, eua	#3477
Sal de sódio de ácido algínico de algas marrons	Sigma-Aldrich,uk	A0682
Cloreto de cálcio	Sigma-Aldrich,uk	C1016
CellTiter96 AQual de proliferação celular de uma solução	Promega, EUA	G3580
Encapsulador	Inotech	IE-50	Nº de série 05.002.01-2005
HEPES	Sigma-Aldrich,uk	H4024
Solução salina tamponada com fosfato	Sigma-Aldrich,uk	D1408
Cloreto de sódio	Sigma-Aldrich,uk	433209
Citrato de trispdium di-hidratado	Sigma-Aldrich,uk	W302600-K
Solução de tripsina-EDTA	Sigma-Aldrich,uk	T4049