Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pela revisão veterinária JoVE
Nota: Comece identificando a população murina alvo. Em estudos anteriores, apenas camundongos C57 / Bl6 machos do tipo selvagem foram usados. No entanto, vários camundongos transgênicos ou knockout também podem ser usados. Observe que as coordenadas estereotáxicas são baseadas na anatomia C57 / Bl6. Recomenda-se que cada usuário verifique inicialmente a localização do traço na substância branca.
1. Indução de AVC da substância branca - abordagem angular medial
- Comece preparando uma pipeta de vidro puxado usando um tubo capilar de 0,5 mm com um diâmetro distal entre 15-25 μm.
- Prepare uma alíquota estéril de 10 μl de L-Nio (cloridrato de N(5)-(1)-iminoetil-L-ornitina) a 27,4 mg/ml (130 μM) em solução salina normal estéril a 0,9%.
- Pré-encha a pipeta de vidro puxado com um pequeno volume de L-Nio (2-5 μl) fixando a pipeta de vidro na tubulação conectada a uma linha de vácuo. Coloque a pipeta plana na bancada e insira a extremidade puxada na solução de L-Nio.
- Aplique o vácuo até que pelo menos 2 mm da porção de 0,5 mm da pipeta estejam cheias. Desligue o aspirador e retire a pipeta. Coloque-o de lado até a Etapa 1.12.
- Coloque o camundongo em uma câmara de indução e induza a anestesia do camundongo usando isoflurano padrão a 32% fluído através de um vaporizador (5 L / min inalado com 5 L / min de oxigênio e 0,5 L / min de nitrogênio) por 1 min ou até que esteja profundamente anestesiado. Transferir o rato para um aparelho estereotáxico equipado com um microscópio estereotáxico. Fornecer anestesia de manutenção usando isoflurano a 32% fluído através de um vaporizador (2 L/min inalado com 5 L/min de oxigênio e 0,5 L/min de nitrogênio) e um cone nasal. Verifique a profundidade da anestesia com um beliscão no dedo do pé.
- Ajuste o braço de injeção para 36°.
- Fixe um porta-pipetas de vidro puxado na extremidade distal de um sistema de injeção de pressão de baixo volume e fixe-o ao braço de injeção da configuração estereotáxica.
- Cubra os bigodes do animal anestesiado com vaselina e coloque pomada lacrimal artificial sobre os dois olhos. Prepare um campo cirúrgico estéril colocando um campo estéril sobre a cabeça do animal com uma abertura de 5 a 10 cm sobre a cabeça. Prepare uma superfície cirúrgica asséptica raspando o pelo que cobre o crânio. Limpe o couro cabeludo com betadine alternado e cotonetes com álcool 70%.
- Faça uma incisão no couro cabeludo na linha média de 1,5 cm com uma tesoura fina estéril para expor a superfície do crânio. Seque o crânio com um cotonete estéril e, usando um microscópio estereotáxico com ampliação de 1-3X, remova qualquer tecido periosteal sobrejacente usando uma ferramenta de microponto estéril.
- Marque o Bregma como ponto de referência usando um marcador de ponto fino.
- Faça uma craniotomia elíptica de 2 mm usando uma broca cirúrgica estéril de ponta fina, começando posteriormente no Bregma e estendendo-se anteriormente à esquerda da linha média. Remova fragmentos ósseos e tecidos moles sobrejacentes para que o córtex cerebral possa ser visualizado.
- Mantenha o campo cirúrgico e a superfície cortical úmidos aplicando intermitentemente gotas de solução salina estéril.
- Fixar uma pipeta de vidro puxado no braço injector do aparelho estereotáxico. Alinhe a extremidade distal da pipeta com o Bregma e zere as coordenadas estereotáxicas.
- Avance a pipeta para as primeiras coordenadas anterior/posterior (A/P) e medial/lateral (M/L) fornecidas na Tabela 1.
- Avance a pipeta para a superfície cortical e zere a medição dorsal/ventral (D/V).
- Passe lentamente a pipeta para o cérebro até atingir a primeira coordenada D/V na Tabela 1.
- Usando um sistema de injeção de pressão de baixo volume ajustado em 20 psi para pulsos de 20 ms, injete 100 nl de L-Nio no cérebro e aguarde 5 minutos para evitar o refluxo na pista da pipeta.
- Use um retículo calibrado na ocular do microscópio estereotáxico e uma ampliação de 3X.
- Assim, desloque um total de 0,100 mm3 (0,5 mm de comprimento em uma pipeta de 0,5 mm de diâmetro, correspondente a 100 nl) da pipeta de vidro puxado para cada conjunto de coordenadas. Usando uma retícula, meça e padronize, pois cada configuração varia de acordo com a ampliação e as escalas usadas.
- Para uma medição precisa do volume durante cada injeção, aproxime-se da pipeta angular com o microscópio lateralmente para que o menisco hidroaéreo tenha uma visão sagital. O menisco deve aparecer no mesmo plano focal das paredes interna e externa da pipeta.
- Retire lentamente a pipeta e repita as etapas 1.13-1.16.3 no segundo e terceiro conjunto de coordenadas fornecido na Tabela 1.
- Após a injeção final, remova a pipeta e coloque cera óssea suficiente para preencher o local da craniotomia. Aproxime as bordas da ferida do couro cabeludo e prenda com adesivo dérmico.
- Injete 0,1 ml de marcaína a 0,5% nas margens da ferida usando uma agulha estéril de 30 G para evitar a dor local associada à incisão no couro cabeludo.
- Retorne o animal ao alojamento e forneça antibióticos pós-operatórios (0,48 mg/ml sulfametoxazol-trimetoprima ou 0,5 mg/ml de levofloxacina) na água de bebida por 5 dias.
