Detecção de interações proteína-proteína em larvas de Drosophila usando um ensaio de ligação de proximidade

Resumo

Fonte: Wang, S., et al. Detecção de Complexos proteína-proteína in situ na junção neuromuscular larval de Drosophila usando ensaio de ligação de proximidade. J. Vis. Exp. (2015).

Este vídeo demonstra a visualização das interações proteína-proteína na junção neuromuscular (NMJ) Drosophila usando o Ensaio de Ligação de Proximidade (PLA). Depois de isolar as paredes do corpo, as proteínas que interagem são sondadas com anticorpos primários e anticorpos secundários conjugados com PLA. A proximidade das proteínas que interagem facilita a ligação de sondas com oligonucleotídeos conectores, formando DNA circular, que é então amplificado por amplificação de círculo rolante. As sondas fluorescentes se ligam ao DNA amplificado, permitindo a visualização das interações proteína-proteína na JNM.

Protocolo

1. Preparação da parede corporal

NOTA: A preparação das paredes corporais larvais de terceiro ínstar (para estudo das JNMs que inervam os músculos da parede corporal) foi realizada conforme descrito anteriormente, mas com algumas modificações.

1. dissecção
   1. Levante os estoques de moscas e cruzamentos a 25 ° C por cinco a seis dias usando procedimentos padrão.
   2. Escolha larvas rastejantes de terceiro ínstar de frascos ou garrafas usando uma pinça fina.
   3. Lave as larvas em uma pequena placa de Petri contendo tampão fosfato salino (PBS) para remover quaisquer partículas de alimentos.
   4. Coloque uma única larva em um disco silgard e mergulhe-a em algumas gotas de PBS gelado. O uso de PBS gelado ajudará a atordoar a larva, tornando-a mais fácil de manipular. Durante toda a dissecação, certifique-se de que a preparação esteja sempre submersa em PBS para evitar que seque.
   5. Posicione a larva com o lado dorsal voltado para cima de modo que os dois tratos traqueais sejam visíveis sob um microscópio de dissecação (Figura 1A). Usando a pinça para segurar um pino minuciano, prenda a larva na extremidade posterior perto dos espiráculos (Figura 1B). Com outro alfinete, perfure a cutícula na extremidade anterior perto dos ganchos da boca. Estique suavemente a larva no sentido do comprimento e, em seguida, prenda-a (Figura 1B).
   6. Usando uma tesoura de microdissecação, aperte a extremidade posterior perto do pino para criar uma pequena abertura. A incisão deve ser superficial o suficiente para passar apenas pela cutícula.
   7. Colocando a ponta da lâmina inferior da tesoura na incisão, corte ao longo de todo o comprimento da linha média dorsal entre os dois tratos traqueais (Figura 1C). Aponte as lâminas da tesoura ligeiramente para cima ao cortar para evitar danificar os músculos da parede ventral do corpo.
   8. Faça uma pequena incisão horizontal ligeiramente anterior ao pino colocado posteriormente (Figura 1C). Faça outra incisão semelhante ligeiramente posterior ao pino colocado anteriormente (Figura 1C). As incisões devem passar apenas pela cutícula.
      nota: As três incisões das etapas 1.1.7 e 1.1.8 combinadas devem se assemelhar a uma "" quando concluídas, ou seja, um retalho esquerdo e direito no lado dorsal do corpo larval deve ser produzido.
   9. Limpe cuidadosamente os órgãos internos com a pinça. Adicionar algumas gotas fortes de PBS ajudará a deslocar os órgãos para fora do corpo larval, facilitando a remoção. Evite cutucar o corpo larval, pois isso causará danos aos músculos da parede corporal.
   10. Abra o corpo da larva e prenda os cantos para baixo (Figura 1D). Ao prender, estique a parede do corpo horizontal e verticalmente para formar um retângulo uniformemente tensionado (consulte a Figura 1G para a forma), tomando cuidado para não rasgar os músculos da parede do corpo no processo.
   11. Termine de remover todos os órgãos internos restantes (Figura 1E).
2. Fixação e permeabilização
   1. Mergulhe as paredes do corpo fixadas em várias gotas da Solução de Bouin. Incube por 15 min no gelo. Alternativamente, use paraformaldeído a 4% (PFA) como fixador alternativo; incubar por 30 min.
   2. Enxágüe três vezes com tampão fosfato salino com Triton (PBT).
   3. Usando uma pinça fina, remova cuidadosamente os pinos e transfira as paredes do corpo pelos cantos para um tubo de microcentrífuga siliconizado de 0,65 ml.
   4. Armazene as paredes da carroceria em PBT a 4 °C até que estejam prontas para o PLA. Para obter os melhores resultados, comece a imunomarcar as paredes do corpo dentro de um ou dois dias após a dissecção.
      nota: Para economizar reagentes e garantir que todas as paredes corporais sejam tratadas igualmente durante o ensaio, diferentes genótipos podem ser colocados em um único tubo. Os genótipos podem ser distinguidos cortando os cantos das paredes do corpo de forma diferente (ver Figura 1F, por exemplo).

2. Imuno-histoquímica

NOTA: A imunomarcação das paredes corporais das larvas de terceiro ínstar foi realizada conforme descrito anteriormente, mas com algumas modificações.
nota: Execute todas as etapas em temperatura ambiente e com agitação suave, salvo indicação em contrário.

1. Bloqueio
   1. Lave as paredes da carroceria com PBT três vezes por 10 minutos cada.
   2. Bloqueio com albumina de soro bovino (BSA) a 1% por 1 hora.
2. Imunocoloração
   1. Incube as paredes do corpo com anticorpos primários de camundongo e coelho contra as duas proteínas de interesse (diluídas em 1% de BSA) por 2 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. Neste caso, use 1:10 camundongo anti-Dlg (Dlg = discos grandes) e 1:250 coelho anti-HtsM (HtsM: Hu-li tai shao mutante). Anticorpos contra marcadores que não são produzidos em camundongos ou coelhos também podem ser incluídos - por exemplo, use anti-Hrp de cabra 1:200 (Hrp = peroxidase de rábano) para delinear as membranas neuronais.
   2. Lave com PBT três vezes por 10 min cada.
   3. Incubar com anticorpos secundários conjugados com fluoróforo para detectar os marcadores (diluídos em 1% BSA) por 2 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C. Como o sinal PLA é posteriormente visualizado com um fluoróforo vermelho, outro fluoróforo deve ser usado para detectar o marcador - por exemplo, use anti-cabra conjugado com isotiocianato de fluoresceína 1:200 (FITC) para detectar o anticorpo anti-Hrp de cabra. Devido ao uso de reagentes sensíveis à luz, mantenha os tubos no escuro a partir deste ponto.
      nota: O kit utilizado permite que o PLA seja realizado entre anticorpos primários criados em camundongos e coelhos, com o sinal visualizado no canal vermelho sob microscopia confocal. Se desejado, estão disponíveis outros kits que permitem que o ensaio seja feito com anticorpos primários criados em outras espécies e o sinal visualizado em outros canais.

3. Ensaio de ligadura de proximidade

NOTA: Execute todas as etapas em temperatura ambiente e com agitação suave, salvo indicação em contrário.

1. Sondas PLA
   1. Lave as paredes da carroceria com PBT três vezes por 10 minutos cada.
   2. Incubar com sondas de PLA (diluição 1:5 cada em 1% de BSA) por 2 horas a 37 °C. Neste caso, use 40 μl de sonda PLA anti-mouse MINUS, 40 μl de sonda PLA anti-coelho PLUS e 120 μl de 1% BSA para garantir a imersão e mistura adequadas de 5 a 10 paredes corporais. Uma diluição de até 1:25 das sondas PLA ainda pode resultar em uma relação sinal-ruído adequada (ou seja, para este experimento).
2. Ligadura
   1. Lave as paredes da carroceria com o tampão de lavagem A duas vezes por 5 min cada.
   2. Incubar com solução de ligadura (diluição 1:40 de ligase em tampão de ligação) por 1 hora a 37 ° C. Neste caso, use 5 μl de Ligase, 40 μl de tampão de ligação 5 e 155 μl de água de alta pureza para garantir a imersão e mistura adequadas de 5 a 10 paredes do corpo.
3. amplificação
   1. Lave as paredes da carroceria com o tampão de lavagem A duas vezes por 2 minutos cada.
   2. Incubar com solução de amplificação (diluição 1:80 da polimerase em tampão de amplificação) por 2 horas a 37 ° C. Neste caso, use 2,5 μl de polimerase, 40 μl de tampão de amplificação 5 e 157,5 μl de água de alta pureza para garantir a imersão e mistura adequadas de 5 a 10 paredes do corpo.
4. Preparação para imagens
   1. Lave as paredes da carroceria com Wash Buffer B duas vezes por 10 min cada.
   2. Lave com 0,01x Wash Buffer B uma vez por 1 min.
   3. Equilibre em algumas gotas de solução de montagem por pelo menos 30 minutos antes da montagem ou armazene durante a noite a 4 °C.
   4. Usando uma pinça fina, transfira cuidadosamente as paredes do corpo para uma lâmina de plataforma com as cutículas voltadas para baixo. Posicione as paredes do corpo em fileiras e na mesma orientação dentro de uma ou duas gotas de montagem. Coloque uma lamínula de 22 mm x 40 mm sobre a preparação, tomando cuidado para não gerar bolhas de ar, depois sele a lâmina com esmalte transparente.
   5. Armazene as lâminas no escuro a -20 °C até que estejam prontas para a imagem confocal.

Resultados

Figura 1: Preparação das paredes do corpo larval do terceiro ínstar. (A-F) Desenhos esquemáticos representando uma dissecção da parede do corpo. (A) Coloque uma única larva em um disco silgard com o lado dorsal voltado para cima, de modo que os dois tratos traqueais fiquem visíveis. (B) Prenda a larva nas extremidades anterior e posterior com pinos minucianos, estic...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Fórceps (fino #5)	Almedic	A10-704
Disco Sylgard	Instrumentos de Precisão Mundial	SYLG184	Misture a base de elastômero e o agente de cura na proporção de 10:1. Defina por 30 min. Despeje em um molde (por exemplo, use uma placa de cultura de células de 12 poços). Deixe curar por pelo menos 24 horas. Cole a tampa de uma placa de Petri de 60x15mm ao dissecar.
Pinos Minutien (diâmetro da ponta de 0,0125 mm)	Ferramentas de Belas Ciências	26002-10
Tesoura de microdissecção (ultrafina)	Ferramentas de Belas Ciências	15200-00
Slides da plataforma			Cole duas lamínulas de 22x22 mm em uma lâmina de microscópio com esmalte transparente, deixando um espaço de <20 mm entre elas para a montagem da amostra.
w1118	Centro de Estoque de Drosophila de Bloomington	3605
hts01103	Centro de Estoque de Drosophila de Bloomington	10989	O estoque foi rebalanceado sobre um balanceador GFP para que mutantes homozigotos possam ser selecionados com base na ausência de sinal GFP.
1x PBS (solução salina tamponada com fosfato): 3mM NaH2PO4, 7mM Na2HPO4, 130mM NaCl, pH 7,0			NaH2PO4 (Laboratórios Caledon - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
Solução de Bouin	Sigma-Aldrich	HT10132
4% PFA (Paraformaldeído): 4% PFA em 1x PBS			PFA (Ciência da Anachemia - 66194-300). Veja doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 para obter instruções sobre como fazer a solução.
1x PBT (solução salina tamponada com fosfato com tritão): 1x PBS com 0,01% de tritão			Triton X-100 (Sigma-Aldrich - T8787)
1% BSA (Albumina Sérica Bovina): 1% BSA em 1x PBT			BSA (Bioshop Canadá - ALB001). Conservar a 4 °C.
mouse anti-Dlg (Discos grandes)	Banco de Hibridoma de Estudos do Desenvolvimento	4F3	Use em uma diluição de 1:10 em 1% BSA.
coelho anti-HtsM (Hu-li tai shao)			Fornecido pela Dra. Lynn Cooley (Universidade de Yale). Use em uma diluição de 1:250 em 1% BSA.
coelho anti-Pak (quinase ativada por p21)			Fornecido pelo Dr. Nicholas Harden (Simon Fraser University). Use em uma diluição de 1:500 em 1% BSA.
mouse anti-Wg (sem asas)	Banco de Hibridoma de Estudos do Desenvolvimento	4D4	Use em uma diluição de 1:5 em 1% BSA.
anti-Hrp de cabra (peroxidase de rábano)	Jackson ImmunoResearch	123-065-021	Use na diluição de 1:200 em 1% de BSA.
Anti-cabra de burro conjugado com FITC	Jackson ImmunoResearch	705-095-003	Use na diluição de 1:200 em 1% de BSA.
Sonda PLA In Situ Duolink anti-mouse MENOS	Sigma-Aldrich	DUO92004
Sonda PLA In Situ Duolink anti-coelho PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002
Reagentes de detecção in situ Duolink vermelho	Sigma-Aldrich	DUO92008
1x Tampão de lavagem A: 0,01M Tris, 0,15M NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Laboratórios Caledon - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific - BP337)
1x Tampão de lavagem B: 0,2 M Tris, 0,1 M NaCl, pH 7,5	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Laboratórios Caledon - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
01x Tampão de lavagem B: 2mM Tris, 1mM NaCl, pH 7,5	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Laboratórios Caledon - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
Meio de montagem in situ Duolink com DAPI	Sigma-Aldrich	DUO82040