Determinação da capacidade de retenção de cálcio de mitocôndrias isoladas

Resumo

Fonte: Li, W., et. al. Ensaio de capacidade de retenção de Ca2+ mitocondrial e ensaio de inchaço mitocondrial desencadeado por Ca2+. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra o procedimento para avaliar a capacidade de retenção de cálcio mitocondrial monitorando as mudanças em tempo real na fluorescência à medida que as mitocôndrias captam cálcio. Este ensaio é útil para estudar a função mitocondrial e processos relacionados ao cálcio, incluindo apoptose e doenças neurodegenerativas.

Protocolo

1. Determinação da capacidade de retenção de Ca²⁺ mitocondrial

1. Preparar o meio de KCl (125 mM de KCl (cloreto de potássio), 2 mM de K₂HPO₄ (fosfato dipotássico), 1 mM de MgCl₂ (cloreto de magnésio), 20 mM de HEPES (ácido 2-[4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il]etanossulfónico), 5 mM de glutamato, 5 mM de malato e 2 μM de rotenona, pH 7,4) e adicione o corante fluorescente verde de ligação de Ca²⁺ a uma concentração final de 0,5 μM antes do experimento.
2. Transfira 1 mL de mitocôndrias isoladas (0,4 mg / mL) em meio KCl contendo 0,5 μM de corante fluorescente verde de ligação a Ca²⁺ em cada poço de placa de 6 poços.
3. Incube as mitocôndrias e o corante fluorescente verde de ligação de Ca²⁺} na placa de 6 poços à temperatura ambiente, protegido da luz ambiente por 1 min. Adicione 4 μL de alíquotas de uma solução de 20 mM de CaCl₂ (cloreto de cálcio) (20 mM de CaCl₂, 127 mM de KCl, 1 mM de MgCl_2, 20 mM de HEPES, 5 mM de glutamato, 5 mM de malato, pH 7,4) a cada poço de placa de 6 poços usando a configuração de dispensação automática para introduzir 200 nmol de Ca²⁺/mg de proteína mitocondrial.
4. Utilizar um espectrómetro de fluorescência para monitorizar as alterações de fluorescência de 3 em 3 s durante 2 minutos, com um comprimento de onda de excitação de 506 nm e um comprimento de onda de emissão de 531 nm. A placa está equipada com agitação a 600 rpm por 3 s entre leituras controladas por software (Figura 1).
5. Adicione uma alíquota adicional de 4 μL de solução de CaCl₂ a cada poço e monitore as mudanças de fluorescência a cada 3 s por 2 min. Repita esta etapa até que a fluorescência aumente com o tempo.
   NOTA: As mitocôndrias são desafiadas com o Ca adicionado²⁺ indicado pelo aumento da fluorescência de gravação. Quando o mPTP (poro de transição de permeabilidade mitocondrial) se abre, a fluorescência aumenta com o tempo.
6. Interprete a quantidade total de Ca²⁺ adicionada até que o mPTP seja aberto como a capacidade de retenção de Ca²⁺.

Resultados

Figura 1: As configurações de software para o ensaio de capacidade de retenção de Ca²⁺.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Verde cálcio-5N	Tecnologias de Vida	c-3737	Corante fluorescente verde de ligação ao cálcio
Glutamato	Sigma-Aldrich	RES5063G-A7
Malato	Sigma-Aldrich	46940-U
Rotenona	Sigma-Aldrich	R8875
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Cloreto de magnésio	Sigma-Aldrich	457
Fosfato dipotássico	Sigma-Aldrich	V900050
KCl	Sigma-Aldrich	Pág. 9541
Cloreto de cálcio	Sigma-Aldrich	V900266