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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação de sistemas de infusão de bomba micro-osmótica
NOTA: Prepare a bomba, o tampão do líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF) e o medicamento (solução de proteína Met-CCL5/RANTES (10 ng/mL em aCSF)) em condições estéreis usando tampões filtrados com filtros de 0.2 μm e conduza todos os procedimentos sob o capuz de cultura com luvas. Os procedimentos cirúrgicos são realizados da seguinte forma:
- Prepare as bombas micro-osmóticas um dia antes da cirurgia: Encha a bomba micro-osmótica cerebral com líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF) com uma seringa de 1 mL e agulha de cabeça romba fornecida junto com o kit. Mergulhe a bomba micro-osmótica em aCSF e coloque-a em um agitador com agitação suave durante a noite.
CUIDADO: A bomba deve ser preenchida com aCSF e bolhas de ar devem ser evitadas dentro da bomba (Figura 1A).
- Antes de iniciar a cirurgia, prepare a solução recombinante de proteína Met-CCL5/RANTES (10 ng/mL, diluída em aCSF) para o experimento. Remova o aCSF da bomba e encha a bomba com a solução do medicamento lentamente até que o excesso vaze.
NOTA: 15 mL de solução de aCSF ou Met-CCL5/RANTES é suficiente para 5-8 bombas.
CUIDADO: Repita o procedimento para garantir que a bomba esteja completamente cheia com o medicamento sem bolhas no interior.
- Corte os tubos do cateter no comprimento desejado e conecte-os à agulha de infusão cerebral de ponta romba do kit de infusão cerebral. Encha o kit de infusão e os tubos com o medicamento.
- Por fim, monte e conecte o kit de infusão cerebral à bomba micro-osmótica.
CUIDADO: Nenhuma bolha deve ser formada no tubo ou na bomba (Figura 1A).
- Mergulhe todo o conjunto de fusão osmótica bomba-cérebro em aCSF em um tubo esterilizado de 50 mL para evitar que a bomba seque. O conjunto de fusão bomba osmótica-cérebro agora está pronto para ser usado para cirurgia.
NOTA: Os sistemas de bomba micro-osmótica podem ser usados para infusão de medicamentos a longo prazo. Isso garante um modo seguro e conveniente de entrega de medicamentos no cérebro do camundongo.
2. Cirurgia Ventricular Intracerebral – implante da bomba micro-osmótica
CUIDADO: Esterilize o ambiente cirúrgico com etanol 75% e certifique-se de que as pessoas envolvidas no estudo estejam usando luvas estéreis e jaleco limpo. As ferramentas/instrumentos cirúrgicos devem ser autoclavados e secos antes do uso e posteriormente esterilizados com etanol a 75% entre as cirurgias com camundongos.
- Pese o camundongo e anestesieste-o com injeção intraperitoneal (IP) com cetamina/xilazina (cetamina 50 mg/kg, xilazina 10 mg/kg).
CUIDADO: Pesos corporais de camundongos inferiores a 24 g não são recomendados para cirurgia de implante de bomba osmótica.
- Monte e fixe a cabeça do mouse no aparelho estereotáxico (Figura 1B).
- Use uma tesoura cirúrgica e pinças para abrir a pele externa que cobre o crânio. Use iodo para limpar o crânio periférico.
- Separe a camada mais externa da pele subcutânea com a ajuda de um par de pinças de cabeça romba perto da região do pescoço para o implante do conjunto de fusão bomba-cérebro osmótico (Figura 1C).
- Marque o ponto de infusão com referência ao mapa cerebral (Figura 1D) usando o aparelho estereotáxico. Neste experimento, a agulha precisa ser implantada na região do3º ventrículo (Bregma: 0,0 mm lateral, 1,3 mm posterior, 5,7 mm ventral).
- Faça um furo usando uma broca de pregos ao redor da área marcada no crânio (Figura 1E).
CUIDADO: Tenha cuidado para não quebrar as meninges e vasos sanguíneos do camundongo, evitando assim a ruptura dos microvasos sanguíneos no cérebro.
- Coloque o conjunto de fusão micro-osmótica bomba-cérebro contendo aCSF (como controle) ou droga (solução de proteína Met-CCL5 / RANTES) sob a pele atrás da região do pescoço e insira a agulha de infusão cerebral no orifício perfurado para infundir a droga no cérebro do camundongo ( Figura 1E ). A agulha penetrará nas meninges e entrará no ventrículo. Fixe a agulha no crânio usando gel dessensibilizante de superfície (Figura 1F) e aguarde 1-2 min até que a cola seque. Em seguida, corte a parte saliente na parte superior da agulha (Figura 1G-H).
- Use uma cola adesiva de tecido para curar a ferida de operação na cabeça. Aplique 50 μL da cola em cima da ferida, junte os dois lados da pele e segure por 30 s para permitir que a pele sele (Figura 1I).
CUIDADO: Use uma compressa com álcool 100% para limpar a ferida após a cirurgia e 100 ul de penicilina com estreptomicina para prevenir infecções. nota: A pele do camundongo formará tecido cicatricial e cicatrizará em alguns dias após a administração da cola cirúrgica. A principal vantagem da cola é evitar pontos cirúrgicos, que podem causar irritação ou inflamação da pele.
- Coloque o camundongo em uma gaiola limpa mantida em uma placa quente (aquecida até 37 °C) e espere até que o camundongo se recupere do efeito anestésico.
CUIDADO: É fundamental manter a temperatura corporal do camundongo para aumentar a chance de sobrevivência após a cirurgia.
- Após um período de recuperação de uma semana, os camundongos estarão prontos para novos experimentos, como o Teste Oral de Tolerância à Glicose (OGTT) e o Teste de Tolerância à Insulina (ITT).
3. Teste Oral de Tolerância à Glicose (TOTG)
NOTA: Realize o teste oral de tolerância à glicose 7 dias após a infusão de aCSF e MetCCL5/RANTES (10 ng/mL, 100 μL). Mantenha um jejum de 6 h para os ratos antes do OGTT com suprimento de água suficiente. Mantenha os animais na mesma bancada de trabalho onde serão realizados os experimentos para que possam se aclimatar ao ambiente para reduzir o estresse durante o procedimento.
- Preparação da solução de glicose: Antes de realizar o experimento, prepare a solução de glicose dissolvendo 3,75 g de glicose em 15 mL de H2O destilado.
- Estabeleça um cronograma para registrar as leituras durante o procedimento experimental (Tabela 1).
NOTA: É importante estabelecer um cronograma com intervalos adequados entre cada exame de sangue para permitir um registro preciso durante o experimento.
- Pese cada camundongo após o jejum e calcule a quantidade apropriada de glicose a ser injetada. Por exemplo, se o camundongo pesa 30 g, a quantidade de solução de glicose a ser administrada deve ser de 300 μL.
- Prepare os seguintes instrumentos na bancada:
- Glicosímetro (Pressione o botão Iniciar para verificar o status da bateria; certifique-se de que está funcionando antes do teste.)
- Chip de glicose
- Seringa de insulina (0,3 mL Seringa de insulina)
- Lâminas
- temporizador
- Uma vez que a bancada esteja montada, meça e registre o nível de glicose no sangue da seguinte forma: Coloque um chip de glicose limpo e novo no glicosímetro e pressione o botão Iniciar para zerá-lo.
- Pegue o mouse pela nuca e acaricie a cauda algumas vezes para garantir fluxo sanguíneo suficiente para a região da cauda.
- Usando uma nova lâmina de barbear para cortar um pequeno pedaço da cauda e espremer uma pequena gota de sangue (cerca de 10-20 μL) no chip de glicose. O sangue deve preencher o chip para permitir uma medição precisa. O glicosímetro exibirá o nível de glicose imediatamente. Se a máquina apresentar um "erro", repita o procedimento com um novo chip de glicose.
NOTA: O chip de glicose requer apenas uma gota de sangue. Quando a amostra de sangue precisar ser coletada mais de uma vez, basta aplicar pressão passando os dedos ao longo da cauda do camundongo várias vezes enquanto segura a ponta da cauda diretamente em cima do chip para coletar sangue. Não é necessário cortar a extremidade da cauda todas as vezes durante a coleta de amostras de sangue.
- Em seguida, alimente os camundongos com glicose (0,25 g / mL) por via oral usando a técnica de gavagem intragástrica. A quantidade de glicose a ser administrada deve ser calculada usando a fórmula: 10X peso corporal (PC) μL de solução de glicose (por exemplo, se o camundongo pesar 30 g, a quantidade de solução de glicose a ser administrada será de 300 μL). Inicie o cronômetro imediatamente após a administração de glicose oral.
- Repita o procedimento de medição de glicose em 15, 30, 60, 90 e 120 min.
- Depois que todas as leituras do nível de glicose forem registradas, descarte as lâminas de barbear e os chips de glicose em um recipiente de risco biológico. Coloque a comida de volta nas gaiolas dos ratos e devolva-os à sala dos animais.
Tabela 1. Cronograma para registro do Teste Oral de Tolerância à Glicose (OGTT)
| # | ID do mouse | corpo | glicose | começar | 0 | 15 | 30 | 60 | 90 |
| | peso | μL = 10xBW | Hora | Minutos | Minutos | Minutos | Minutos | Minutos |
| 1 | 501 | 25,8 ouros | 258 | 9:00 | 9:00 | 9:00 | 9:15 | 9:30 | 10:00 |
| algarismo | 502 | 25,3 ouros | 253 | 09:07 | 09:07 | 09:07 | 9:22 | 09:37 | 10:07 |
