Indução experimental de glaucoma via obstrução do ângulo iridocorneano em um modelo de camundongo

Resumo

Fonte: Bunker, S., et al. Glaucoma experimental induzido por injeção ocular de microesferas magnéticas. J. Vis. Exp. (2015)

Neste vídeo, um rato anestesiado passa por um procedimento ocular onde esferas magnéticas são injetadas na câmara anterior sob um campo magnético para bloquear o ângulo iridocorneano. Esse bloqueio obstrui a malha trabecular, impedindo a drenagem do humor aquoso e levando ao aumento da pressão intraocular, danificando as células ganglionares da retina e o nervo óptico. Isso desenvolve uma condição semelhante ao glaucoma.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Indução de hipertensão ocular

1. Induzir o glaucoma experimental elevando a pressão intraocular (PIO) por meio da injeção unilateral de microesferas paramagnéticas na câmara anterior de ratos Brown Norway. Outros ratos pigmentados podem ser adequados, embora o usuário precise validá-los primeiro.
2. Abriga 250-300 g de ratos fêmeas ex-reprodutoras Brown Norway em um ambiente constante de pouca luz (40-60 lux) para minimizar as flutuações diurnas na PIO, com acesso a comida e água.
3. Faça medições basais da PIO em animais acordados8 antes da anestesia e injeção de esferas, usando um tonômetro de rebote calibrado para uso no olho de rato9. A PIO é tomada como a média de cinco leituras.
4. Anaestésico em ratos com 37,5 mg/kg de cetamina e 0,25 mg/kg de cloridrato de medetomidina administrados por via intraperitoneal. Confirme a profundidade da anestesia testando os reflexos do pé traseiro do animal antes da aplicação de iodopovidona (consulte a etapa 1.5) e a injeção de esferas (consulte a etapa 1.8). Administre cloridrato de proparacaína a 0,5% para analgesia.
   NOTA: Não dilate a pupila em nenhum estágio. Isso ajudará as contas a se acomodarem melhor no ângulo iridocorneano e evitará a ligação ao cristalino. Aplique pomada ocular para evitar o ressecamento da córnea no olho contralateral não operado.
5. Lave o olho operatório com iodopovidona a 5% em água 5 minutos antes da injeção.
6. Após 5 min, retire a iodopovidona com gaze estéril e lave o olho com solução salina estéril a 0,9%. Mantenha o olho úmido durante a anestesia com a aplicação regular de solução salina estéril.
7. Coloque um ímã toroidal ao redor do olho.
8. Injetar 25 μl de uma solução contendo 30 mg/ml de microesferas magnéticas de 8 μm esterilizadas por irradiação gama na solução salina balanceada de Hank (HBSS) na câmara anterior usando uma agulha chanfrada de 33 G.
   1. Para preparar as contas, lave ressuspendendo e centrifugando 3 vezes a 10.000 x g por 5 min com 1 ml de HBSS antes de fazer a solução final de 30 mg / ml. Mantenha as condições estéreis por toda parte.
   2. Para a injeção, tenha cuidado para evitar inserir a agulha na íris, para minimizar o risco de trauma da íris. Isso pode ser evitado orientando a agulha tangencial à superfície da córnea, o mais paralela possível à íris. Isso também ajudará a minimizar a perda de grânulos do local da injeção.
      NOTA: Injete grânulos em uma taxa rápida para garantir uma distribuição uniforme ao redor do ângulo iridocorneano, o que é fundamental para aumentar a PIO. Além disso, armazene miçangas, agulhas e anéis magnéticos separadamente para que as contas não formem aglomerados, dificultando o carregamento na seringa e a injeção, e a agulha não fique magnetizada.
9. Deixe a agulha no lugar por 1 minuto após a injeção para garantir que as esferas se depositem no ângulo iridocorneano para impedir a drenagem aquosa da malha trabecular. Incline ligeiramente a agulha depois que os grânulos tiverem se acomodado inicialmente para permitir algum vazamento de água No final da cirurgia, lave a agulha com primeiro solução salina tamponada com fosfato (PBS), depois etanol a 70%, seguido de água destilada, para garantir o uso contínuo da agulha em procedimentos separados. Alternativamente, pode-se usar agulhas descartáveis se a combinação correta de medidor e seringa estiver disponível. Opcional: as agulhas podem ser afiadas com chanfrador para prolongar seu uso.
10. Nesta fase, se necessário, remova o ímã e use-o para atrair contas em áreas de cobertura incompleta.
11. Deixe o ímã no lugar ao redor do olho por mais 10 minutos após a injeção para garantir que as esferas se encaixem bem no ângulo iridocorneano.
12. Anestesia reversa com cloridrato de atipemezol 0,25 mg/kg.
13. Administre cloranfenicol ou outra pomada antibiótica, por exemplo, gentamicina ou terramicina topicamente para prevenir infecções e cloridrato de proparacaína a 0,5% para analgesia. Deixe os animais se recuperarem em um tapete térmico até que recuperem o movimento, depois transfira-os para uma caixa quente e forneça-lhes nutrição adicional, como um suplemento alimentar ou dieta regular umedecida, até que a recuperação seja completa. Analgesia sistêmica ou local deve ser administrada a animais que apresentem sinais de dor 24 horas após a cirurgia. Se esses sintomas persistirem apesar do tratamento, os animais devem ser abatidos humanamente.
14. Use o olho contralateral como um controle não operado.
15. Faça medições de PIO a cada 2-3 dias após a administração do grânulo e a cada 2-3 dias a partir de então, usando um tonômetro de rebote calibrado para uso no olho do rato.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
250-300g fêmeas de ratos reprodutores da Noruega Marrom	Harlan Reino Unido	203
Tonolab Tonômetro de Rebote	Tiolat	TV02
Ketaset (cetamina)	Fort Dodge Saúde animal	BN1000118	37,5 mg/kg
Domitor (cloridrato de medetomidina)	Orion Pharma	140-999	0,25 mg/kg
Povidona iodo	Ecolab	BN4369LE10	5% em H2O
Solução salina de Minim	Bausch e Lomb	PL00033/5017
Ímã toroidal	Supermagnete	R-10-07-03-N
Microesferas magnéticas	Laboratórios Bangs	UMC4N/9692
HBSS	Invitrogen	14025
Agulha chanfrada de calibre 33	Hamilton	7747-01	Agulha personalizada
Seringa de ponta Luer	Hamilton	80601
Antisedan (cloridrato de atipemezol)	Orion Pharma	141-003	0,25 mg/kg
Pomada de cloranfenicol	Medicom	18956-0005