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Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Preparação de lâminas e tecidos
- Use lâminas de preparação de silano ou lâminas de vidro de membrana de naftalato de polietileno (PEN).
- Para isolamento de RNA, mergulhe as lâminas em solução de descontaminação de RNase, lave 3 vezes com água sem RNase e depois desidrate com uma série graduada de etanol sem RNase e seque a vácuo por 30 min.
- Corte seções de tecido com 10 μm de espessura usando um criostato e monte nas lâminas livres de RNase preparadas. Mantenha as seções congeladas durante o seccionamento para preservar a qualidade do RNA. NOTA: Certifique-se de que o tecido esteja a aproximadamente 4 mm de distância das bordas da lâmina, pois o LCM não pode remover o tecido que está muito próximo das bordas da lâmina. Para remover o tecido de uma lâmina de membrana PEN, certifique-se de que o tecido esteja a 4 mm da esquerda, superior e inferior e 7 mm do lado direito da lâmina, que são as dimensões da membrana que não está presa à lâmina.
- Para isolamento de populações de células individuais usando imuno-histoquímica direta, corte o tecido nas lâminas de preparação de Silano ou nas lâminas de membrana PEN. Para isolamento de regiões de tecido usando técnicas guiadas por imuno-histoquímica indireta, monte um conjunto de seções em uma lâmina de preparação de Silano para imuno-histoquímica e seções alternadas em uma lâmina de membrana PEN e/ou uma lâmina de preparação de Silano a ser usada para LCM.
2. Preparação de tecido para captura a laser - imuno-histoquímica rápida de tirosina hidroxilase para captura direta a laser de células imunorreativas
- Delineie o tecido com uma caneta hidrofóbica e deixe secar.
- Fixe o tecido em solução de acetona-metanol (1:1) a -20 °C por 10 min. NOTA: Nossa experiência mostrou que a fixação de acetona-metanol resultou em imuno-histoquímica muito mais consistente do que a acetona ou o metanol sozinhos.
- Enxágue a lâmina em solução salina tamponada com fosfato (PBS) com Triton a 1% (sem RNase).
- Cubra as seções com 100-200 μl de PBS com Triton a 1% com anticorpo tirosina hidroxilase diluído 1:100 com 400 U / ml de RNasin. Incube por 5-10 min.
- Enxágüe brevemente em PBS duas vezes e PBS-1% Triton.
- Cubra o tecido com 100-200 μl de IgG anti-coelho de cabra marcado com Alexa Fluor 488 diluído 1:100 em PBS-1% Triton com 400 U/ml de RNasin e 50 ng/ml de DAPI. Incube por 5 min.
- Enxágue 2 vezes em PBS e desidrate 30 s em uma série graduada de etanol livre de RNase (75%-75%-95%-95%-100%-100%).
- Incube em duas lavagens de xileno por 1 min e depois 5 min.
- Remova as lâminas do xileno imediatamente antes de usar para LCM e deixe secar ao ar.