Imuno-histoquímica de seções de tecido cerebral de camundongos para direcionar neurônios dopaminérgicos

Resumo

Fonte: Kummari, E., et. al., Microdissecção por captura a laser - Uma demonstração do isolamento de neurônios dopaminérgicos individuais e toda a área tegmental ventral., J. Vis. Exp. (2015)

Neste vídeo, demonstramos o protocolo de imuno-histoquímica para neurônios dopaminérgicos em seções de tecido cerebral para posterior microdissecção de captura a laser.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Preparação de lâminas e tecidos

1. Use lâminas de preparação de silano ou lâminas de vidro de membrana de naftalato de polietileno (PEN).
2. Para isolamento de RNA, mergulhe as lâminas em solução de descontaminação de RNase, lave 3 vezes com água sem RNase e depois desidrate com uma série graduada de etanol sem RNase e seque a vácuo por 30 min.
3. Corte seções de tecido com 10 μm de espessura usando um criostato e monte nas lâminas livres de RNase preparadas. Mantenha as seções congeladas durante o seccionamento para preservar a qualidade do RNA. NOTA: Certifique-se de que o tecido esteja a aproximadamente 4 mm de distância das bordas da lâmina, pois o LCM não pode remover o tecido que está muito próximo das bordas da lâmina. Para remover o tecido de uma lâmina de membrana PEN, certifique-se de que o tecido esteja a 4 mm da esquerda, superior e inferior e 7 mm do lado direito da lâmina, que são as dimensões da membrana que não está presa à lâmina.
4. Para isolamento de populações de células individuais usando imuno-histoquímica direta, corte o tecido nas lâminas de preparação de Silano ou nas lâminas de membrana PEN. Para isolamento de regiões de tecido usando técnicas guiadas por imuno-histoquímica indireta, monte um conjunto de seções em uma lâmina de preparação de Silano para imuno-histoquímica e seções alternadas em uma lâmina de membrana PEN e/ou uma lâmina de preparação de Silano a ser usada para LCM.

2. Preparação de tecido para captura a laser - imuno-histoquímica rápida de tirosina hidroxilase para captura direta a laser de células imunorreativas

1. Delineie o tecido com uma caneta hidrofóbica e deixe secar.
2. Fixe o tecido em solução de acetona-metanol (1:1) a -20 °C por 10 min. NOTA: Nossa experiência mostrou que a fixação de acetona-metanol resultou em imuno-histoquímica muito mais consistente do que a acetona ou o metanol sozinhos.
3. Enxágue a lâmina em solução salina tamponada com fosfato (PBS) com Triton a 1% (sem RNase).
4. Cubra as seções com 100-200 μl de PBS com Triton a 1% com anticorpo tirosina hidroxilase diluído 1:100 com 400 U / ml de RNasin. Incube por 5-10 min.
5. Enxágüe brevemente em PBS duas vezes e PBS-1% Triton.
6. Cubra o tecido com 100-200 μl de IgG anti-coelho de cabra marcado com Alexa Fluor 488 diluído 1:100 em PBS-1% Triton com 400 U/ml de RNasin e 50 ng/ml de DAPI. Incube por 5 min.
7. Enxágue 2 vezes em PBS e desidrate 30 s em uma série graduada de etanol livre de RNase (75%-75%-95%-95%-100%-100%).
8. Incube em duas lavagens de xileno por 1 min e depois 5 min.
9. Remova as lâminas do xileno imediatamente antes de usar para LCM e deixe secar ao ar.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Silane prep-slides	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	S4651
95% Ethanol-RNase Free	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	E7148
100% Ethanol-RNase Free	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	E7023
Rnase Free Triton	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T8787
Anticorpo anti-tirosina hidroxyase	EDM Millipore, Billerica, MA	Ab152
Alexa Fluor 488 cabra anti-coelho IgG	Life Technologies, Grand Island, NY	A-11008
RNaseZap	Life Technologies, Grand Island, NY	AM9780