Estudando o tráfego de proteínas de membrana em células fotorreceptoras de Drosophila

Resumo

Fonte: Wagner, K. et al., Estudando o tráfego de proteínas de membrana em células fotorreceptoras de Drosophila usando proteínas marcadas com eGFP. J. Vis. Exp. (2022).

Este vídeo demonstra a visualização do tráfego de proteínas de membrana em células fotorreceptoras de Drosophila usando proteínas TRPL marcadas com eGFP. Ele detalha a preparação de moscas transgênicas para imagens, a captura de imagens de fluorescência de células fotorreceptoras e a quantificação do tráfego de TRPL medindo a fluorescência relativa de eGFP nos rabdômeros.

Protocolo

1. Considerações gerais

1. Use estoques de Drosophila expressando proteínas translocadoras permanentemente localizadas rabdomeralmente para análises relacionadas ao tráfego de proteínas (por exemplo, canal iônico semelhante ao potencial do receptor transitório (TRPL):: proteína fluorescente verde aprimorada (eGFP), Arrestin 2 ( Arr2)::eGFP).
2. Predetermine as condições de exposição à luz de moscas selecionadas para a abordagem experimental.
   1. Para adaptação ao escuro, mantenha as moscas em caixas escuras pelo período desejado a 25 °C. Para iluminação até 16 h em experimentos de translocação (por exemplo, moscas que expressam TRPL::eGFP), mantenha as moscas sob um tubo fluorescente à temperatura ambiente.
   2. Para iluminar moscas com luz colorida, use caixas de plástico transparentes de cores diferentes junto com o tubo fluorescente.

2. Microscopia

1. de imersão em águaFly preparation
   1. Prepare o espaço de trabalho com o equipamento e reagentes necessários, conforme mostrado na Figura 1. Transfira moscas com idade e condições de iluminação predeterminadas para um tubo de centrífuga pré-resfriado de 15 mL e anestesia-as incubando-as no gelo por 15 a 30 min.
      NOTA: Leve moscas adaptadas ao escuro com 1 dia de idade como referência. Geralmente, as moscas adaptadas ao escuro devem ser transferidas para uma geladeira com tampa no escuro. As moscas adaptadas à luz podem ser transferidas para o gelo na luz ambiente.
   2. Transfira uma mosca anestesiada com gelo de cabeça para uma ponta de pipeta de 200 μL e empurre a mosca em direção à ponta cuidadosamente com ar comprimido.
   3. Corte a ponta da pipeta bem na frente da cabeça usando um bisturi. Usando uma pinça, empurre cuidadosamente a mosca alguns milímetros para longe da ponta. Corte a ponta da pipeta novamente e empurre a mosca de volta para a ponta com ar comprimido de modo que apenas a cabeça da mosca se projete da ponta da pipeta.
   4. Cole um pedaço de plasticina em uma lâmina de objeto e pressione a ponta da pipeta de modo que o olho esquerdo ou direito da mosca fique voltado para cima (Figura 2A). Imediatamente antes da aquisição da imagem, use uma pipeta de laboratório para aderir uma grande gota de água gelada na parte inferior de uma objetiva de imersão em água (Figura 2B). Prossiga imediatamente para a aquisição de imagens para obter melhores resultados.
      NOTA: Um atraso significativo na aquisição da imagem resulta no despertar e nos movimentos da mosca, o que pode levar a imagens borradas.
      
2. Image acquisition
   1. Coloque cuidadosamente a lâmina do objeto com a mosca preparada no microscópio stage e selecione uma objetiva de imersão em água.
   2. Abaixe a objetiva de imersão em água manualmente até que o olho da mosca toque a gota (Figura 3A, B).
   3. Ligue a lâmpada UV do microscópio e selecione o conjunto de filtros apropriado. Use as oculares para posicionar a mosca sob a objetiva e focar o microscópio na superfície do olho.
   4. Alterne o caminho da luz em direção à câmera do microscópio e gere uma imagem ao vivo no software correspondente. Reajuste o foco da câmera e avalie a orientação do olho, considerando que o olho deve estar voltado para a objetiva do microscópio radialmente, conforme ilustrado com mais detalhes na Figura 3C-E.
   5. Use a LUT apropriada (tabela de pesquisa) no software de imagem para detectar supersaturação (indicada como pixels vermelhos).
   6. No caso de moscas não pigmentadas, ajuste o tempo de exposição de forma que os pixels mais brilhantes fiquem logo abaixo do limite de saturação para cada imagem.
   7. Grave uma imagem e salve-a como um arquivo bruto para arquivar todos os metadados correspondentes da gravação. Exporte a imagem em um formato .tif para a quantificação a seguir.
      NOTA: Ilumine as moscas por 5 minutos com luz vermelha (por exemplo, 630 nm) imediatamente após a aquisição da imagem, se elas forem usadas para experimentos futuros. A luz vermelha desativa a cascata de fototransdução que foi ativada excessivamente pela intensa luz de ondas curtas durante a aquisição da imagem.
      
3. Análise de dados e quantificação da fluorescência relativa de eGFP nos rabdômeros de micrografias de imersão em água
   1. Baixe, instale e execute o software ImageJ/Fiji.
   2. Ajuste as configurações do ImageJ clicando em >Analisar > Definir Medidas... e marque apenas a caixa Valor médio de cinza. Importe uma imagem .tif clicando em Arquivo > Abrir... ou arrastando e soltando. Escolha uma região representativa da imagem que esteja em foco e amplie-a para 200%-300% pressionando repetidamente Ctrl e + juntos.
   3. Selecione a ferramenta Oval e, enquanto pressiona a tecla Shift, gere uma seleção circular na imagem que seja significativamente menor do que um rabdomere fluorescente. Antes de soltar o botão do mouse, procure o tamanho exato exibido abaixo da barra de ferramentas na janela principal do ImageJ. Use o mesmo tamanho de seleção circular para todas as análises.
      NOTA: O tamanho exato da seleção circular em pixels ou mícrons depende da configuração específica. Use um círculo de aproximadamente 1/3 ou 1/4 do diâmetro rabdomêmero de moscas de controle adaptadas ao escuro com 1 dia de idade.
   4. Mova a seleção circular clicando com o mouse nela e arrastando ou pressionando as teclas de seta no teclado.
   5. Para medir as intensidades de fluorescência dentro da seleção circular, mova o círculo para o primeiro rabdomere (r1) e clique em >Analyze > Measure ou use o atalho Ctrl + M. Uma janela de resultados listando o valor de cinza medido será exibida.
   6. Continue com as medições de r2-r6 como medições repetidas e uma medição do sinal de fundo (b). No caso de moscas não pigmentadas, efectuar medições adicionais das áreas do corpo celular correspondentes (c1-c6) (figura 4).
   7. Repita as etapas 2.3.5 e 2.3.6 para mais dois omatídeos, resultando em três replicações técnicas. Marque os omatídeos analisados usando a ferramenta Lápis e salve essa imagem para documentação.
   8. Selecione e copie os valores de cinza medidos da janela Resultado e cole-os no software de planilha para cálculos adicionais. Classifique os valores de intensidade de fluorescência de acordo com sua origem nas categorias rabdomômero (r), corpo celular (c) e fundo (b). Calcule a intensidade média de cada categoria (Ir, Ic, Ib).
   9. Calcule a quantidade relativa de eGFP presente no rabdomere.
   10. Continue com a próxima imagem na etapa 2.3.3. Recomenda-se o uso de imagens de pelo menos cinco indivíduos de cada grupo experimental como réplicas biológicas para obter uma medição confiável.

Resultados

Figura 1: Espaço de trabalho de microscopia de imersão em água. Os materiais necessários são: (A) tubo de centrífuga de 15 mL, (B) flocos de gelo, (C) água destilada gelada, (D

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
15 mL centrifuge tube	Greiner Bio-One	188271
Carbon dioxide anaesthesia fly pad	Flystuff	59-172
Lâmpada de luz fria (KL 1500 LCD)	Zeiss
Fiji/ImageJ	NIH
Microscópio de fluorescência com lâmpada UV, câmera, conjunto de filtros e software (AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 blue edition)	Zeiss
Fluorescent tube	Osram	4050300518039.00
Pipeta de laboratório (20-200 μL)	Eppendorf
Object slide	Roth	656.1
Pontas de pipeta (200 μL)	Labsolute	7695844
Plasticine (Blu-Tack)	Bostik	30811745
Stereo microscope (SMZ445)	Nikon
Stereo microscope with UV lamp, camera, filer set and software (MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12)	Leica