Detecção de modificações de histonas em células de levedura com superexpressão de proteínas neurodegenerativas

Resumo

Fonte: Bennett, S. A., et al., Caracterizando alterações de modificação pós-tradução de histonas em modelos de proteinopatia neurodegenerativa de levedura. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo demonstra o procedimento de avaliação de modificações de histonas em células de levedura que superexpressam proteínas neurodegenerativas. As etapas incluem lise celular, centrifugação, eletroforese, transferência de membrana e detecção baseada em anticorpos de histonas modificadas.

Protocolo

1. Lise celular e western blotting para detectar modificações pós-traducionais de histonas

1. Cell lysis
   1. Descongele os pellets de células de levedura em gelo e ressuspenda os pellets celulares em 100 μL de dH₂O.
   2. À ressuspensão celular, adicione 300 μL de NaOH 0,2 M e 20 μL de 2-mercaptoetanol. Ressuspenda pipetando para cima e para baixo.
   3. Incube as células no gelo por 10 min e depois centrifugue a 3.200 x g em uma centrífuga de mesa por 30 s em RT. Descarte o sobrenadante.
   4. Ressuspenda o pellet celular em 100 μL de corante de carga 1x e ferva por 10 min em um bloco de aquecimento.
      NOTA: A receita para o corante de carregamento 6x pode ser encontrada na Tabela de Materiais.
2. Eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida e transferência de membrana
   1. Prepare a câmara de gel colocando dois géis em um suporte de gel, enchendo a câmara interna até o topo com tampão de corrida e enchendo a câmara externa até a marca da linha de dois gels.
   2. Carregue 15 μL de amostra por poço em um gel de poliacrilamida a 10 poços a 12%. Para a pista da escada de proteínas, carregar 5 μL.
   3. Execute o gel por aproximadamente 45 minutos a 150 V ou até que a frente do corante de carregamento atinja o fundo do gel.
   4. Enquanto o gel estiver funcionando, prepare-se para a transferência da membrana embebendo almofadas de fibra (duas por gel) em tampão de transferência (Tabela de Materiais) e embebendo a membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) em metanol. Enxágue a membrana no tampão de transferência antes da transferência.
      NOTA: A membrana de PVDF deve ser cortada no tamanho do gel e usar uma membrana de PVDF para cada gel que está sendo transferido.
   5. Monte, em uma célula de aparelho de transferência semi-seca, um 'sanduíche' de transferência: do eletrodo inferior, coloque (1) uma almofada de fibra pré-embebida, (2) membrana PVDF pré-embebida e enxaguada, (3) gel e (4) uma segunda almofada de fibra pré-embebida.
      NOTA: Para evitar bolhas de ar no 'sanduíche' de transferência, 'role suavemente o 'sanduíche' com uma pipeta sorológica para forçar a saída das bolhas. Uma vez que o gel tenha sido colocado em cima da membrana PDVF, não o mova.
   6. Para realizar a transferência de proteínas, defina a fonte de alimentação para 150 mA por 1 h (para um 'sanduíche').
3. Detecção de modificações pós-traducionais de histonas (PTMs) com anticorpos específicos de modificação
   1. Remova a membrana do aparelho de transferência. Enxágue brevemente com dH₂O.
      1. Opcionalmente, verifique a transferência de proteínas com a coloração de Ponceau-S despejando coloração de Ponceau-S suficiente para cobrir a membrana em uma pequena caixa de plástico e incubando em RT com agitação suave por 30−60 s. Remova a coloração de Ponceau-S e enxágue com dH₂O até que a mancha de fundo desapareça e as bandas de proteína sejam visíveis a olho nu. Continue a enxaguar com dH₂O até que toda a mancha seja removida da membrana.
   2. Bloqueie a membrana incubando a mancha por 1 h em RT com balanço suave em tampão de bloqueio de solução salina tamponada com tris (TBS) (Tabela de Materiais) em uma pequena caixa de coloração. Use tampão de bloqueio suficiente para cobrir o borrão.
      NOTA: Tenha o cuidado de colocar a membrana na vertical na caixa de coloração de forma que o lado da membrana sobre o qual as proteínas estão não fique voltado para baixo.
   3. Incube o borrão na caixa de coloração durante a noite com um anticorpo específico de modificação de histona reativo à levedura a 4 °C. Dilua o anticorpo no tampão de bloqueio TBS de acordo com as especificações do fabricante. Inclua também um controle de carga nuclear adequado, como H3 anti-total levantado em uma espécie hospedeira diferente do anticorpo específico de modificação. Por exemplo, se sondar H3S10ph com um anticorpo anti-H3S10ph criado em coelhos, use um anticorpo H3 anti-total criado em camundongos como controle de carga. Repita isso para cada mancha, conforme necessário.
      NOTA: As diluições de anticorpos podem ser reutilizadas por um total de três vezes em um mês. Armazene-os a 4 °C.
   4. Lave a membrana 4x em TBS caseiro + 0,1% de polissorbato 20 (TBST) por 5 min com balanço em RT.
   5. Incubar o borrão com anticorpos secundários fluorescentes em diluições especificadas pelo fabricante (anti-coelho 680 e anti-rato de burro) por 1 h em RT.
      NOTA: Os anticorpos secundários fluorescentes devem ser protegidos da luz durante o armazenamento e o uso. Realize a incubação em caixas plásticas escuras ou cubra com papel alumínio.
   6. Lave a membrana 4x com TBST por 5 min e lave com TBS por 5 min enquanto balança em RT.
   7. Visualize blot em um sistema de imagem fluorescente Western blot por 2 min. Visualize os anticorpos secundários anti-coelho 680 e anti-camundongo 800 nos canais de 800 nm e 700 nm, respectivamente.
      NOTA: As réplicas são conduzidas de forma independente a partir da seção 1. Para uma interpretação apropriada dos dados nesses experimentos, é necessário verificar se a resposta do sinal do anticorpo está dentro da faixa em que a resposta do sinal é linear.

Materiais

< >< table class='width:665pt;'table class='ck-table-resized'Lista de materiais utilizados neste artigo Nome Empresa Número de catálogo Comentários 10x Running Buffer Mistura: 141,65 g de glicina (ThermoFisher BP381-1), 30,3 g de base Tizma (Sigma-Aldrich T6066), 10 g de dodecil sulfato de sódio (Sigma-Aldrich L3771) e 1 L de água deionizada, pH 8,8.12% de géis de poliacrilamidaBIO-RAD456-1041 2-mercaptoethanolSigma-AldrichM3148 Anti-acetil-histona H3 (Lys14) Primário AnticorpoMilliporeSigma07-353 (Lote nº 2762291)Diluição: 1/1000Anti-acetil-histona H4 (Lys16) Anticorpo primárioAbcamab109463 (Lote nº. GR187780)Diluição: 1/2000Anti-acetil-histona H4 (Lys12) Anticorpo primárioAbcamab46983 (Lote nº. GR71882)Diluição: 1/5000Anti-dimetil-histona H3 (Lys36) Anticorpo primárioAbcamab9049 (Lote nº. GR266894, GR3236147)Diluição: 1/1000Anticorpo primário anti-histona H3Abcamab24834 (lote nº. GR236539, GR174196, GR3194335)Controle de Carga Nuclear; Diluição: 1/2000Anti-phospho-Histone H2B (Thr129) Anticorpo primárioAbcamab188292 (Lote nº. GR211874)Diluição: 1/1000Anti-phospho-Histone H3 (Ser10) Anticorpo primárioAbcamab5176 (Lote nº. GR264582, GR192662, GR3217296)Diluição: 1/1000BioPhotometer D30Eppendorf6133000010 Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 REppendorf22625501Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CWLI-COR926-32212 (Lote nº C60301-05, C61116-02, C80108-05)Diluição: 1/5000Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RDLI-COR926-68073 (Lote nº C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07)Diluição: 1/2500EthanolSigma-AldrichE7023 Papel de borrão extra grosso (papel de filtro)BIO-RAD1703968 Membranas de transferência Immobilon-FLMilliporeSigmaIPFL00010 Loading Dye Mix: 1,2 g de dodecil sulfato de sódio, 6 mg de azul de bromofenol (Sigma-Aldrich B8026), 4,7 mL de glicerol, 1,2 mL 0,5M Trizma base pH 6,8, 0,93 g de DL-Ditiotreitol ( Sigma-Aldrich D0632) e 2,1 mL de água deionizada. Metanol < td estilo = 'largura: 108 pt; '> ThermoFisher < estilo td = 'largura: 108pt; '> A412-4 < td estilo = 'largura: 314pt; '> < td estilo = 'altura: 15,75 pt; largura: 135pt; '> Célula de eletroforese vertical Mini-PROTEAN Tetra < td estilo = 'largura: 108pt; '> BIO-RAD < estilo td = 'largura: 108pt; '>1658004 < estilo td = 'largura: 314pt; '> < estilo td = 'altura: 15,75 pt; largura: 135 pt; '> pipeta multicanalEppendorf2231300045 Nuclease Free WaterQiagen129114 Odyssey Fc Imaging SystemLI-COR Biosciences2800-03<TD estilo='largura:'largura:314pt;'> pAG303GAL-a-synuclein-GFPGift from A. Gitler pAG303GAL-ccdBAddgene14133 pAG303Gal-FUSAddgene < estilo td = 'largura: 108pt;'>29614 pAG303GAL-TDP-43 < estilo td = 'largura: 108pt;'> Presente de A. Gitler < estilo td = 'largura: 108pt;'> < estilo td = 'largura: 314pt;'> < estilo td = 'altura: 15,75pt; largura: 135pt;'>Poli (etilenoglicol) (PEG)Sigma-AldrichP4338Prepare uma solução a 50% p/v.Ponceau S StainSigma-AldrichP3504Mix: 0,5 g 0,1% p/p Corante Ponceau S, 5 mL 1% v/v ácido acético (Sigma-Aldrich 320099) e 500 mL de água deionizada.PowerPac Basic Power SupplyBIO-RAD164-5050 Buffer de carregamento de dodecil sulfato de sódio Conservar a -20 oC. 6X, Mix: 1,2 g de dodecil sulfato de sódio, 6 mg de azul de bromofenol, 0,93 g de DL-Ditiotreitol, 2,1 mL de água deionizada, 4,7 mL de glicerol e 1,2 mL de base de 0,5 M Trizma, pH 6,8.Sodium hydroxideSigma-Aldrich221465Prepare a solução de 0,2 M.TBS + 0.1% Tween 20 (TBST) Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949) e 900 mL de água deionizada. TBS Blocking Buffer < td style = 'width: 108pt;'>LI-COR927-5000 Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer CellBIO-RAD170-3940 Transfer Buffer Mistura: 22,5 g de glicina, 4,84 g de base de Tizma, 400 mL de metanol, 1 g de dodecil sulfato de sódio e 1,6 L de água deionizada.Tris-Buffered Saline (TBS)<td style='width:108pt;'> 10X, 7.6 pH, Solução: Misture 24 g de base Trizma e 88 g de cloreto de sódio (Sigma-Aldrich S7653). Encha até 1 L com água deionizada.WT 303 S. cerevisiae yeastGift from J. Shorter