Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.
1. Sujeitos
- Use ratos Sprague-Dawley machos (250-300 g na chegada).
- Ratos domésticos em gaiolas de fundo sólido em uma sala de colônia com umidade de 40-60% e temperatura ambiente (RT) de 21 ± 1 °C.
- Disponibilizar água e comida à vontade.
- Mantenha os ratos em um ciclo escuro / claro reverso de 12:12 horas (luzes acesas às 20 horas).
2. Cirurgia
- Por rato, prepare dois pedaços de ligadura intestinal crômica (5-0) de aproximadamente 6 cm de comprimento e coloque-os em solução salina estéril para evitar que sequem e fiquem rígidos e quebradiços.
- Anestesiar o animal com pentobarbital (60 mg/kg, intraperitoneal [i.p.]) e tratar com atropina (0,1 mg/kg, i.p.). Monitore o nível de anestesia estendendo uma perna e beliscando a teia de pele entre os dedos dos pés com a unha para garantir que a pressão adequada seja aplicada. Certifique-se de que o animal não flexione o membro. Se necessário, administre pentobarbital adicional.
- Raspe a cabeça do rato para que uma incisão no couro cabeludo na linha média possa ser feita de aproximadamente 25 mm com distâncias iguais anterior e posterior ao centro dos olhos.
- Fixe a cabeça do rato em uma moldura estereotáxica ou fixe a cabeça do rato. Coloque o rato em uma almofada aquecida para manter a temperatura corporal.
- Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos para evitar danos causados pelo ressecamento.
- Esfregue a área da cabeça raspada com álcool e, em seguida, betadine.
- Faça uma incisão no couro cabeludo na linha média, expondo o crânio e o osso nasal.
- Use um microscópio de operação para executar as etapas 2.9 a 2.16.
- Dissecar a borda da órbita livre, formada pelos ossos maxilar, frontal, lacrimal e zigomático, usando um cotonete e um par de pinças Dumont. Use o cotonete para absorver o sangue de um possível sangramento.
- Para dar acesso ao nervo infraorbital (IoN), desvie suavemente o conteúdo orbital com um cotonete de precisão, tomando cuidado para não esticar demais o nervo etmoidal anterior que cruza superior ao IoN. Disseque a IoN livre do tecido conjuntivo circundante, usando um cotonete de precisão com ponta de algodão e um par de pinças Dumont usando um movimento de espalhamento. Use o cotonete para absorver o sangue de um possível sangramento.
- Para realizar uma ligadura, empurre uma extremidade de um único pedaço de intestino crômico para baixo ao longo do osso frontal, medial ao IoN e avance alguns milímetros paralelos e inferiores ao IoN. A ligadura agora é mantida no lugar entre o IoN e o osso frontal.
- Deslize a ponta de uma pinça Dumont com ângulo de 45 graus sob o IoN para colocá-la próxima à ligadura. Retraia suavemente o IoN lateralmente para revelar a ligadura e a ponta da pinça. Segure a ligadura com a pinça e retire-a lateralmente de baixo do IoN.
- Retire a ligadura da cavidade orbital até que ambas as extremidades da ligadura estejam mais ou menos equidistantes do IoN.
- Faça um "nó corrediço" das duas extremidades da ligadura para permitir um controle perfeito sobre o grau de constrição e deslize o nó contra o IoN. Deslize o nó ainda mais para contrair o IoN de modo que o diâmetro do nervo seja reduzido em uma quantidade perceptível. Faça um nó normal em cima do nó deslizante para que a quantidade de constrição permaneça constante (ou seja., para evitar que o nó de fenda escorregue).
- Corte as ligaduras para deixar aproximadamente 2 mm de extremidades livres do nó.
- Repita o mesmo procedimento (etapas 2.11 a 2.15) para fazer uma segunda ligadura com 2 mm de distância da primeira.
- Para cirurgia simulada, execute as etapas 2.2 a 2.10.
- Feche a incisão no couro cabeludo com suturas de poliéster (4-0) e permita que o rato se recupere em uma almofada aquecida. Não deixe o animal sozinho até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal e não devolva o animal à companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado.
- Para evitar efeitos analgésicos preventivos no desenvolvimento da dor neuropática, não administre analgesia para dor pós-cirúrgica.