Geração de um modelo esferóide tridimensional de invasão de células tumorais

Abstract

Fonte: Guyon, J., et al. Um modelo esferóide 3D para glioblastoma. J. Vis. Exp. (2020)

O vídeo demonstra a geração de um modelo esferóide tridimensional de invasão de células tumorais. Os esferóides são formados a partir de células tumorais cerebrais humanas e incorporados em uma matriz de colágeno. As células tumorais na periferia esferóide adotam um fenótipo invasivo, secretando proteases para degradar o colágeno e avançando para invadir a matriz circundante.

Protocol

1. Geração de esferoides tumorais de tamanho uniforme

NOTA: As células-tronco são cultivadas em meio neurobasal complementado com suplemento B27, heparina, fator de crescimento de fibroblastos 2 (FGF-2), penicilina e estreptomicina. Essas células formam esferoides espontaneamente em cultura.

1. Lave as células tumorais com 5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e incube as células com 0,5-1 mL de enzima de dissociação por 5 minutos a 37 °C.
2. Lave com 4-4,5 mL de PBS e adicione 10 mL do meio de crescimento completo (meio neurobasal completo, cNBM).
3. Conte as células usando uma técnica de contagem automática com azul de tripano e uma lâmina de câmara de contagem de células.
4. Para gerar 100 esferoides com 10⁴ células por esferóide (de acordo com o tamanho preferido), misture 10⁶ células em 8 mL de NBM com 2 mL de 2% de metilcelulose.
5. Transfira a suspensão para um recipiente de sistema estéril e dispense 100 μL/poço com uma pipeta multicanal em uma placa inferior redonda de 96 poços.
6. Incube a placa a 37 °C, 5% de CO₂ e 95% de umidade. Esferóides de tamanho igual se formarão e podem ser usados após 3-4 dias.

2. Experimentos

1. tridimensionaisInvasion
   1. Preparation
      1. Prepare a matriz de colágeno em um tubo de gelo com colágeno tipo I na concentração final de 1 mg/mL, 1x PBS,_colágeno 0,023xV, hidróxido de sódio 1 M e H₂O estéril. Incube a solução em gelo por 30 min.
      2. Colete os esferoides da placa de fundo redondo em tubos de 500 μL e lave 2x com 200 μL 1x PBS.
      3. Pipete os esferoides cuidadosamente em 100 μL da matriz de colágeno e insira no centro de um poço em placas normais de 96 poços.
      4. Incube o gel de colágeno por 30 min a 37 °C e, em seguida, adicione cNBM em cima do gel. Inibidores ou ativadores (por exemplo, cloreto de hidrogênio, conforme mostrado na Figura 1B, 1C) podem ser adicionados ao meio nesta etapa.
   2. Aquisição e análise de imagens
      1. Tire fotos sequencialmente com um videomicroscópio no modo de campo claro 24 h após a inclusão do colágeno.
      2. Use Fiji para analisar imagens manualmente ou de maneira semiautomatizada. Para fazer isso manualmente, desenhe ao redor do núcleo e da área total do esferóide com a ferramenta de seleção à mão livre e meça a área invasiva de cada esferóide subtraindo a área total com a área do núcleo. Para analisar as imagens de maneira semiautomatizada, use uma macro para determinar a área invasiva.

Results

Figura 1: Glioblastoma P3 esferóide em ensaios de proliferação, invasão ou migração. (A) Ensaio de proliferação. Painel esquerdo: Imagens representativas com DMSO como controle ou com 20 μM de rotenona (inibidor do complexo I da cadeia respiratória) no tempo 0 ou 72 h. Painel direito: Quantificação da área esferóide representada como linhas tracejadas nas ...

Materials