Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Extração de α-sinucleína (αS) de regiões cerebrais dissecadas
- Dissecar um cérebro inteiro em uma placa de Petri de plástico de 35 mm no gelo com uma lupa de baixa potência (ampliação de 8X) usando dois forcipes cujas extremidades são mantidas juntas, exceto ao dissecar o hipocampo. Não exceda 10 min para preservar a integridade do cérebro. Coloque o cérebro com o lado direito para cima e recupere as seguintes regiões cerebrais nesta ordem:
- Separe um dos dois bulbos olfativos usando uma pinça colocada logo atrás dele. Separe-o do cérebro movendo-o para baixo. Repita esta operação para a segunda lâmpada.
- Gentilmente coloque a pinça entre os dois córtices e mova-a para frente para facilitar a dissociação dos dois córtices. Mantendo o cérebro no lugar com uma pinça, use outra para separar o córtex do hipocampo.
- Posicione a pinça 2 mm abaixo do córtex. Mantenha uma leve pressão na pinça até que a parte superior do hipocampo esteja visível. Retire a primeira parte do córtex e repita com a segunda parte. Use a pinça para separar os dois córtices começando no hipocampo e movendo-se em direção à frente do cérebro.
- Posicione a pinça aberta ao redor de um dos hipocampos. Feche a pinça na parte inferior do hipocampo e remova-a com cuidado, recuperando o máximo possível. Repita o procedimento para o segundo hipocampo.
- Posicione a pinça aberta abaixo de uma das estrias e separe-a suavemente do cérebro. Use o fórceps para remover qualquer córtex remanescente do estriado. Repita este procedimento para o segundo estriado.
- Use a pinça para deprimir suavemente o contorno do cerebelo em 2 mm para facilitar sua separação do cérebro. Coloque a pinça logo atrás do cerebelo e remova-a movendo a pinça para frente.
- Use a parte larga da pinça para levantar o mesencéfalo para ver claramente onde ele se junta ao tronco cerebral. Faça uma incisão vertical na junção e remova o tronco cerebral.
- Posicione a pinça atrás do mesencéfalo, que é composto por quatro estruturas arredondadas. Incisar verticalmente até que o mesencéfalo esteja completamente separado do cérebro restante.
- Prepare homogeneizados de porcentagem variável (peso/volume) em tampão com alto teor de sal (HS), dependendo do número de tecidos disponíveis: homogeneizado de 5% para um peso entre 10 e 30 mg, 10% para um peso entre 30 e 80 mg e 20% para um peso acima de 80 mg.
- Adicione um volume adequado de tampão HS às regiões cerebrais dissecadas para obter a % esperada de homogeneizado.
- Vortex e verifique se os tecidos estão totalmente imersos no tampão HS.
- Homogeneize amostras preparadas a partir das regiões dissecadas do cérebro ou da medula espinhal cervical com um moedor de tecido composto por um tubo de vidro borossilicato e dois pilões, A e B.
- Despeje cada região do cérebro a ser esmagada diretamente no tubo. Insira o pilão A no tubo e retraia-o. Repita esse movimento cerca de dez vezes para dissociar o tecido. Em seguida, use o pilão B para continuar a moer o tecido com mais 20 movimentos. Transferir os homogeneizados para um tubo de 1,5 ml com uma pipeta de transferência de 1 ml.
- Centrifugue as amostras a 1.000 x g por 5 min a 4 °C para eliminar quaisquer fragmentos cerebrais não moídos. Retirar os sobrenadantes, dividi-los em alíquotas de 200 μl e mantê-los a -80 °C para análise posterior.
1. Detecção de αS por ELISA
- Diluir os anticorpos de revestimento para 0,01 ng/ml. Utilizar o anticorpo anti-αS policlonal de coelho ou monoclonal clone 42 em tampão 50 mM Na2CO3/NaHCO3 (pH 9,6).
- Cubra as microplacas de 96 poços com 100 μl por alvéolo desta solução de revestimento e deixe a 4 °C O/N. Use o anticorpo policlonal de coelho anti-αS na solução de revestimento para ELISAs usando anticorpos de detecção syn514, clone 42, LB509, AS11, 4D6 ou 8A5. Use o anticorpo monoclonal anti-αS clone 42 como solução de revestimento em combinação com o anticorpo de detecção anti-pSer129 αS.
NOTA: Se necessário, as placas podem ser mantidas a 4 °C durante uma semana antes da realização do ELISA. - Use uma lavadora de placas para lavar as placas cinco vezes com 300 μl de solução salina tamponada com fosfato com 0,05% de Tween 20 (PBST) por poço. A partir desta etapa, a incubação está em RT.
- Adicione 200 μl de tampão de bloqueio T20 PBS (solução salina tamponada com fosfato) por poço. Agite por 1 hora a 150 rpm. Lave as placas cinco vezes com PBST.
- Dilua os homogeneizados cerebrais (diluição 1:100 dos homogeneizados de 20%, 1:50 dos homogeneizados de 10% e 1:25 dos homogeneizados de 5% em PBST BSA 1%) e adicione 100 μl a cada poço. Em seguida, incube por 2 horas agitando a 150 rpm. Lave as placas cinco vezes com PBST.
- Adicione os diferentes anticorpos de detecção αS em PBST com albumina de soro bovino (BSA) 1% nas diluições mencionadas na Lista de Materiais. Incubar por 1 hora a 150 rpm. Lave as placas cinco vezes com PBST.
- Adicione conjugados IgG HRP anti-rato ou anti-coelho diluídos 1:8.000 em PBST suplementados com BSA 1% por 1 hora agitando a 150 rpm. Lave as placas cinco vezes com PBST.
- Adicione 100 μl de solução de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) a cada poço e incube por 15 min no escuro enquanto agita a 150 rpm.
- Pare a reação adicionando 100 μl de HCl 1 N por poço e meça a absorbância a 450 nm com o leitor de microplacas.
- Para análise de dados, subtraia o valor de OD obtido em um poço com todos os reagentes, exceto quaisquer amostras de cérebro de camundongo (poço em branco) dos valores de OD medidos para cada uma das amostras analisadas.