Gerando um Traumatismo Cranioencefálico Leve de Cabeça Fechada em um Modelo Murino

Resumo

Fonte: Logsdon, A. F., et al. Modelo de onda de choque de baixa intensidade para avaliação pré-clínica de lesão cerebral traumática leve de cabeça fechada em roedores. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demonstra a indução de lesão cerebral traumática leve na cabeça fechada em um modelo de camundongo usando uma configuração de tubo de choque de gás pressurizado. A onda de pressão gerada rompe a membrana de poliéster, entregando uma onda de choque na cabeça do camundongo que resulta em um rápido movimento cerebral dentro do crânio, causando uma lesão cerebral traumática leve.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Preparação de setup experimental e indução de traumatismo cranioencefálico (TCE) leve em roedores

NOTA: Transfira roedores para a área de espera 30 minutos a 1 h antes do início dos experimentos de traumatismo cranioencefálico (TCE) para se aclimatar. Selecione uma área de espera que seja minimamente afetada pelo ruído do procedimento.

1. Prepare todos os materiais necessários para o experimento e verifique a configuração para a instalação adequada (ex., ajuste os parâmetros de acordo com o objetivo do estudo) (~5 – 10 minutos).
   NOTE: A gravidade da lesão pode ser ajustada selecionando a espessura da membrana de poliéster. Com base em nossos estudos, uma espessura de membrana de 25,4 a 102 μm é utilizada para TCE leve a moderado em camundongos. Anteriormente, utilizamos membranas com espessura de 76,2 a 127 μm para produzir TCE leve a moderado em ratos.
   1. Corte cuidadosamente a membrana de poliéster, insira-a entre as seções acionada e acionadora e prenda-a apertando os parafusos de conexão.
   2. Conecte o tanque de gás ao tubo de choque através do uso de conexões de liberação rápida. Certifique-se de que a membrana esteja firmemente fixada entre as seções do acionador e do acionamento.
   3. Coloque três sensores de pressão na saída do tubo de choque, separados por 120°, para monitorar as propriedades da onda de choque durante a indução do TBI.
   4. Certifique-se de que a distância da extremidade do aparelho do tubo de choque esteja correta para cada assunto respectivo usando o micrômetro instalado. Mantenha o posicionamento da cabeça do roedor (i.e., posição, distância) constantes dentro dos estudos para permitir uma avaliação consistente da lesão.
      NOTE: Diferentes tipos de lesão podem ser induzidos selecionando a direção em que a onda de choque afeta a cabeça. Para o procedimento de indução de TCE leve a moderado descrito aqui, o corpo é colocado perpendicularmente ao tubo de choque, onde a onda de choque impacta a lateral da cabeça. Nesse cenário, a cabeça tem mobilidade livre e, portanto, é exposta à onda de choque e às forças rotacionais rápidas, permitindo a geração de efeitos de golpe e contragolpe.
   5. Inicie a gravação a partir dos sensores de pressão usando a interface gráfica do usuário (GUI) do software.

2. Anestesia e posicionamento de roedores em setup

1. Transfira roedores da sala de espera e induza anestesia com isoflurano a 4% em oxigênio e mantenha com isoflurano a 2% em oxigênio para reduzir o sofrimento e a dor.
   NOTE: Certifique-se de que o animal não responda ao beliscão do dedo do pé ou da cauda antes de prosseguir. Certifique-se de que a indução da anestesia seja consistente para todos os animais experimentais, incluindo controles simulados. Este procedimento requer anestesia de baixo nível e curta duração.
2. Coloque o roedor totalmente anestesiado na proteção do tubo de cloreto de polivinila (PVC) com amortecimento para proteger os órgãos periféricos da onda de choque.
   NOTE: Os indivíduos de controle são anestesiados e colocados próximos à configuração, mas não são diretamente submetidos à onda de choque. Certifique-se de que os controles estejam sujeitos ao ruído gerado pelo tubo de choque.
3. Coloque a cabeça do roedor dentro da área de colocação da cabeça e apoie-a por baixo, seja por um suporte embutido diretamente no aparelho de proteção ou por uma gaze. Determine o alinhamento da cabeça de acordo com a anatomia de cada roedor, com o côndilo occipital alinhado com a borda da blindagem protetora.
   NOTE: Evite direcionar a onda de pressão diretamente para o tronco encefálico para diminuir a mortalidade. Sabe-se que lesões no centro respiratório do tronco cerebral e na medula espinhal cervical contribuem para anormalidades respiratórias e até morte em modelos de roedores de TCE.

3. Exposição de roedores à onda de choque

1. Abra rapidamente a válvula principal do tanque de gás comprimido para produzir um pico de pressão que rompe a membrana e produz uma explosão alta que confirma a geração de uma onda de pressão. A membrana será visualmente rompida quando removida após o experimento.
   NOTE: Uma câmera de alta velocidade pode ser usada para capturar os efeitos de golpe e contragolpe da aceleração rotacional experimentada pelo roedor para análise posterior.
2. Desligue o fluxo de gás imediatamente após ouvir a explosão.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
3/8 SAE mangueira hidráulica de alta pressão	Eaton Aeroquip	R2-6-6-36M	Available from Grainger
3/8'' Quick connect female plugs	Karcher	KAR 86410440
3/8'' Plugues macho de conexão rápida	Karcher	KAR 86410440
ANY-maze video tracking software	Stoelting Co.	ANY-maze software
Clear mylar membrane	https://www.eplastics.com/	POLYCLR0.003	http://www.eplastics.com/Plastic/Clear_Polyester_Film/POLYCLR0-003; A membrana mylar transparente é vendida em várias espessuras. Todos são vendidos pelo fornecedor listado acima.
Tabela deslizante composta (X2)	Grizzly Industrial	G5757
Válvula de esfera de controle de gás Deadman	Coneraco Inc.	71-502-01	"Apollo", disponível em Grainger
Driver and driven section (murine)<	n/a	Para mais informações, entre em contato com os autores
Ear muffs	3M	37274	Disponível na Grainger
Regulador de gás - Hi-Flow 3500-600-580	Harris	3003539
Gás hélio	AirGas	HE 300	Tanks estão disponíveis em vários tamanhos
Inhalation anesthesia system	VetEquip	901806
Input module	National Instruments	NI 9223
Isoflurane	Baxter	NDC 10019-360-40	Encomendado por veterinário
Temporizador de laboratório/ cronômetro	Fisher Scientific	50-550-352
Labview version 12.0	National Instrumentos		Data acquirion software
Indicador de discagem magnética/micrômetro	Grizzly Industrial	G9849
MATLAB	MathWorks		Software para análise
Regulador de oxigênio	Medline	HCS8725M
PC para processamento de dados	Dell
Polyvinylchloride tubing - 25.4 mm	FORMUFIT	P001FGP-WH-40x3
Pressure sensors	PCB Piezotronics	102A05
Receiver USB chassis	National Instruments	DAQ-9171
Sensor signal conditioner	PCB Piezotronics	482C series
Stainless NSF-rated mounting table	Gridmann	GR06-WT2448
T-Handle allen wrench - 3/16''	S&K	73310

td style='border-left-style:none;border-top-style:none;width:164pt;'>próprio design/produção de registro de pressão