Modelagem de metástase de tumor cerebral por meio de injeção de células cancerígenas na artéria carótida interna

Resumo

Fonte: Lim, M., et al. Modelagem de metástases cerebrais por injeção de células cancerígenas na artéria carótida interna. J. Vis. Exp. (2022)

Neste vídeo, um camundongo anestesiado é submetido a um procedimento cirúrgico no qual células cancerígenas são injetadas na artéria carótida comum (CCA) para facilitar a entrega direcionada ao cérebro. O procedimento envolve sutura e manipulação precisas das artérias carótidas para direcionar as células injetadas para a artéria carótida interna (ACI), promovendo a formação de tumores no cérebro ao longo do tempo.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Preparação de células cancerígenas para injeção

NOTA: Neste estudo, foi utilizada a linhagem celular de câncer de mama humano, BT-474 (BT474). O BT474 foi cultivado em meio de crescimento completo composto por meio RPMI (Roswell Park Memorial Institute Medium) 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de insulina. As células foram mantidas em incubadora a 37 °C com 5% de dióxido de carbono na atmosfera do ar. Autentique a linhagem celular por teste de repetições em tandem por satélite, confirme a expressão da proteína repórter (por exemplo, luciferase), se houver, e verifique se há infecção por micoplasma.

1. Semeie células cancerígenas BT474 com uma densidade de semeadura de 2,0 × 10 ^ 6 células em um frasco T75 usando 10 mL de meio de crescimento completo e cultura (a 37 ° C com 5% de dióxido de carbono) para 70% -80% de confluência antes da injeção.
2. No dia da injeção, descarte o meio de crescimento e lave a monocamada celular duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS).
3. Adicione 5 ml de reagente de dissociação de cultura celular pré-aquecido e incube a 37 °C durante 5 min ou até que as células se tenham desprendido. Após 5 min, bata suavemente no frasco para ajudar no descolamento da célula.
4. Adicione 5 mL de meio de crescimento completo contendo 10% de soro fetal bovino para extinguir a atividade do reagente de dissociação.
5. Ressuspenda suavemente as células pipetando para reduzir os aglomerados de células.
6. Transfira a suspensão celular para um tubo de 50 mL e centrifugue a 180 x g por 3 min em temperatura ambiente.
7. Transvase o sobrenadante e ressuspenda o sedimento celular em 10 mL de solução salina balanceada de Hank (HBSS) sem cálcio e magnésio para minimizar a aglomeração celular.
8. Centrifugar a suspensão celular à temperatura ambiente a 180 x g{TAG_83}} durante 3 min.
9. } Decantar o sobrenadante para remover o soro residual/reagente de dissociação e ressuspender o sedimento celular em 3 ml de HBSS.
10. Coloque um filtro de células de 100 μm em um tubo cônico novo de 50 mL e passe a suspensão celular para remover os aglomerados de células.
    NOTA: Uma suspensão unicelular é essencial para minimizar a oclusão dos vasos sanguíneos e o risco de acidente vascular cerebral na injeção.
11. Calcule o número de células viáveis usando a exclusão de Trypan Blue e um hemocitômetro usando métodos padrão.
12. Diluir a suspensão celular com HBSS até uma concentração celular de 2,5 x 10{TAG_120}}6{TAG_123}} células/mL.
13. Mantenha o tubo na horizontal no gelo e balance suavemente o tubo periodicamente para minimizar a aglomeração. A suspensão celular pode ser armazenada no gelo por no máximo 6 h.
    NOTA: O balanço foi feito manualmente, mas isso também pode ser feito usando um agitador em baixa rotação.

2. Preparação do mouse para o procedimento

NOTA: Neste estudo, foram utilizados camundongos NOD scid fêmeas com 4-5 semanas de idade. Introduza alimentos de recuperação de dieta leve (por exemplo, gel dietético, hidrogel, ração de camundongo amassada) aos camundongos 3 dias antes do procedimento para estimular a alimentação após o procedimento.

1. Ferramentas cirúrgicas em autoclave. Pulverize e limpe a área cirúrgica e o equipamento com desinfetante de superfície, seguido de etanol a 70%.
2. Coloque um tapete térmico para animais sob a placa cirúrgica para evitar hipotermia. Ligue isso 30 minutos antes da cirurgia. Pulverize e limpe a placa cirúrgica com desinfetante de superfície, seguido de etanol a 70%.
3. Prepare uma gaiola limpa para animais e uma almofada de aquecimento quente para recuperação.
4. Coloque equipamento de proteção individual limpo (bata, máscara, rede de cabelo e luvas). Mantenha a esterilidade durante todo o procedimento usando luvas de exame limpas e uma técnica de 'apenas pontas de instrumentos'.
5. Anestesie o camundongo com uma câmara anestésica usando isoflurano a 5% com um fluxo de oxigênio de 2 L/min até que o camundongo perca o reflexo pedal.
6. Retire o animal da câmara e coloque-o em um cone nasal que forneça isoflurano a 2% a um fluxo de oxigênio de 2 L/min para o restante procedimento cirúrgico.
7. Mouse perfurador de orelha para identificação e use tesouras elétricas para raspar o pelo da região do pescoço. Limpe o excesso de pelos da pele exposta usando fita adesiva.
8. Pese o camundongo para calcular as doses de medicamentos anestésicos e analgésicos necessários. Administre buprenorfina e meloxicam a 50 μg/kg e 1 mg/kg, respectivamente, por injeção subcutânea.
9. Transfira o mouse para uma placa cirúrgica quente e prenda o cone do nariz com fita adesiva.
10. Aplique lubrificante ocular nos olhos para evitar o ressecamento.
11. Prenda o mouse com cuidado, primeiro enganchando os dentes incisivos superiores usando uma linha presa à placa cirúrgica, seguida de fita adesiva nas patas dianteiras e traseiras. Esta etapa estende o corpo e mantém o pescoço reto durante o procedimento.
12. Realize a preparação pré-operatória da pele conforme descrito abaixo.
    1. Limpe o pescoço com um anti-séptico tópico (iodopovidona) para reduzir a carga da microflora da pele e remover os pelos soltos. Limpe a partir do centro da pele, trabalhando para fora para evitar a recontaminação do local da incisão. Repita o processo usando etanol 70%. Execute três rodadas alternadas de iodo e etanol para desinfecção.
    2. Coloque uma cortina cirúrgica sobre o animal. Este é cortado e moldado a partir de um pedaço de papel toalha estéril ou saco de autoclave.
13. Disponha toalhas de papel estéreis ou sacos de autoclave para ferramentas cirúrgicas.
14. Verifique se há reflexo via 'Teste de pinça' para garantir anestesia suficiente antes de continuar o procedimento.

3. Injeção interna de carótida

NOTA: Neste experimento, uma cânula de infusão de 31 G e uma configuração de chave de seringa ativada pelo pé foram utilizadas para facilitar o procedimento de injeção. Essa configuração é opcional e o usuário pode usar uma seringa de insulina de 31 G e pular as etapas 3.11 e 3.12. Para preparar a cânula de perfusão, puxe e separe a parte da agulha da parte de encaixe da seringa de uma agulha 31 G utilizando dois pares de pinças de sutura. Em seguida, prenda a porção da agulha em uma extremidade de um tubo de infusão fino com aproximadamente 10 cm de comprimento.

1. Posicione o microscópio de dissecção sobre o mouse.
2. Usando uma tesoura, faça uma incisão vertical de 15 mm ao longo da linha média na região do pescoço, começando de 5 mm abaixo da mandíbula até a entrada torácica.
3. Usando dois pares de pinças angulares, separe a pele e as glândulas salivares subjacentes e aplique afastadores para manter a traqueia exposta. O próximo passo irá expor a bainha carotídea que fica paralela à traqueia.
4. Usando dois pares de pinças de ângulo fino, disseque sem rodeios o músculo e o tecido adiposo adjacentes à traqueia para expor a bainha carotídea direita. A bainha carotídea é a camada fibrosa que cobre a artéria carótida comum, a veia e o nervo vago, e esse feixe pode ser visualizado pela artéria carótida comum vermelha brilhante. Neste estudo, a injeção foi realizada na artéria carótida direita.
5. Limpe um segmento da artéria carótida comum caudal à bifurcação carotídea da fáscia circundante e separe-o do nervo vago e das veias.
6. Isole e limpe a bifurcação carotídea (a junção que une as artérias carótidas externa e interna) dos nervos e fáscia circundantes. Posicione uma pinça fina sob a artéria carótida externa e passe uma sutura de seda (espessura 5-0) sob a artéria. Dê um nó e aperte a sutura e corte o excesso de linha.
   NOTA: Esta ligadura (L1) impedirá que o injetado transite pela artéria carótida externa.
7. Posicione uma pinça fina sob a artéria carótida comum e passe uma sutura de seda (espessura 5-0) sob a artéria. Dê um nó e aperte a sutura em uma posição próxima ao local de injeção proposto. Corte o excesso de sutura, deixando cerca de 10 mm de linha.
   NOTA: Esta segunda ligadura (L2) restringirá o fluxo sanguíneo e o sangramento após a injeção. Também é usado para posicionar e segurar a artéria carótida durante a injeção.
8. Corte e umedeça uma tira de limpadores descartáveis de baixo fiapo (autoclavados) com cerca de 10 mm x 5 mm. Dobre a tira em 4 mm x 5 mm, com 2-3 mm de espessura, e coloque-a embaixo da artéria carótida no local de injeção proposto. Isso apoiará o vaso durante a injeção.
9. Na artéria carótida comum rostral ao local de injeção proposto, coloque uma terceira ligadura (L3) com um nó solto. Este é apertado somente após a injeção (na etapa 3.16).
10. Agite suavemente a suspensão celular e aspire 200 μL de suspensão celular para uma seringa de insulina (com uma agulha de 31 G).
11. Coloque a seringa no driver da seringa, que está conectado a um pedal de ativação.
12. Encaixe uma cânula fina com uma agulha 31 G na seringa e prepare a linha.
13. Verifique se a artéria carótida está bem posicionada e pressurizada.
14. Usando duas pinças angulares finas, uma tensionando suavemente na extremidade da primeira ligadura e a outra segurando a agulha 31 G, insira lentamente a agulha com bisel no lúmen do vaso sanguíneo, tomando cuidado para não perfurá-la.
15. Injete lentamente 100 μL de suspensão celular (a partir do passo 1.13) na artéria carótida comum a 10 μL / s. Isso fornecerá 2,5 × 10 ^ 5 células para o vaso sanguíneo. A injeção bem-sucedida é visualizada via a limpeza do sangue do vaso sanguíneo carotídeo.
16. Levante e aperte suavemente a ligadura solta (L3) (da etapa 3.9) imediatamente após retirar a agulha para evitar refluxo e sangramento. Apare o excesso de sutura.
    NOTA: É normal observar uma pequena quantidade de sangue jorrando após a retirada da agulha. No entanto, não deve haver sangramento ativo após o aperto da terceira ligadura.
17. Remova o pedaço de limpadores descartáveis de baixo fiapo umedecidos.
18. Usando uma pipeta P200, enxágue a cavidade cirúrgica duas vezes com 150-200 μL de água estéril ou solução salina.
19. Verifique novamente se há sangramento e, em seguida, remova os retratores.
20. Reposicione os tecidos moles, as glândulas salivares e a pele sobre a artéria carótida e a traqueia.
21. Feche a camada de pele da incisão usando um porta-agulha de sutura, fórceps e uma sutura de monofilamento 6/0 absorvível ou não absorvível em um padrão contínuo.
22. Descarte a seringa da agulha da cânula e prepare uma nova configuração para o próximo mouse. O uso de uma nova seringa garantirá que o número de células injetadas em cada camundongo seja consistente.
    NOTA: Instantâneos representativos do procedimento estão em Se o vaso for perfurado ou rasgado pela agulha, indicado pelo vazamento de injetado ou sangramento, o procedimento é considerado malsucedido. Em seguida, a agulha deve ser retirada e a terceira ligadura deve ser imediatamente apertada para evitar mais sangramento. Se o sangramento for persistente após o aperto da sutura, o animal deve ser sacrificado com pentobarbital.

4. Recuperação pós-injeção

1. Injete buprenorfina (50 μg/kg) e meloxicam (1 mg/kg) via injeção subcutânea como alívio da dor pós-cirúrgica.
2. Mova o animal para uma gaiola quente e limpa para se recuperar da anestesia. É normal que um animal tenha atividade moderada (amontoado e inativo ou se movendo lentamente) depois de acordar.
3. Após 30-45 min, transfira os ratos para uma instalação de retenção de longo prazo.
4. Forneça aos camundongos uma dieta leve (gel diet, hidrogel, purê) por pelo menos uma semana após a cirurgia e verifique o estado físico diariamente com atenção especial para sinais de acidente vascular cerebral, infecção e sangramento ao redor do local da ferida.
5. Dois dias após a cirurgia, é típico que o animal tenha atividade reduzida, pêlo levemente despenteado e perda de 15% do peso corporal pré-operatório. Administre analgésico (meloxicam) diariamente por 2-3 dias após a cirurgia para controlar a dor e ajudar na recuperação.
6. A partir do dia 3, os animais devem ter recuperado a atividade, aumentado a frequência de alimentação e tosa e recuperado o peso. Eutanasiar animais com déficits persistentes de condição física (dor, amontoados, inativos, perda de peso) após 4 dias após a cirurgia, injetando pentobarbital sódico a 200 mg/kg via {TAG_515}} injeção intraperitoneal.
7. O enxerto e a progressão do tumor podem ser monitorados usando anestesia e modalidade de imagem de escolha, como imagem bioluminescente, ressonância magnética ou PET/MRI. O requisito e a capacidade de realizar tais imagens dependerão inerentemente dos objetivos individuais do projeto e da instalação em que são realizadas e, dependendo do tipo de marca do repórter das linhas celulares usadas, acessibilidade das instalações relevantes de radioquímica e imagens nucleares .
   NOTA: Alguns animais podem não responder bem e sofrer um acidente vascular cerebral, apesar de um procedimento bem-sucedido. Após o procedimento, os animais que apresentarem algum sintoma de sofrimento neurológico (virar a cabeça e puxar para um lado, comportamento circular, rolar, debater-se, perda da função motora) devem ser sacrificados imediatamente.

Resultados

Figura 1: Representação esquemática do protocolo de injeção da artéria carótida interna para metástase cerebral. A injeção da artéria carótida interna com ligadura da artéria carótida externa pode produzir de forma confiável um modelo de metástase cerebral de vários cânceres primários. Neste protocolo, três ligaduras são colocadas na artéria ca...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
30G Microlance needle	BD	23748
31G Ultra-Fine II seringa de insulina	BD	326103
Pinça angular	Proscitech	T67A-SS	Ponta fina, angulada sem serrilhas, ponta de 18mm, comprimento 128 mm
Animal heat mat
Antibiótico e antimicótico	ThermoFisher Scientific	15240062
BT-474 (HTB-20) linha celular de câncer de mama	ATCC	HTB-20
Buprenorfina (TEMGESIC)
Contador de células Countess	ThermoFisher Scientific	C10227
Microscópio
Ear perfurador
Clippers
Pinça angular fina	Proscitech	DEF11063-07	Inclinada 45°, Ponta lisa, Largura da ponta: 0,4 mm, Dimensão da ponta: 0,4 x 0,3 mm, comprimento 9cm
Tubo fino para cânula, Tubo OD (pol) 1/32, ID do tubo (pol) 1/100in	Cole Parmer	EW-06419-00
Soro bovino fetal	ThermoFisher Scientific	26140079
Hank's Balanced Salt Solution sem cálcio e magnésio	ThermoFisher Scientific	14170120
Isoflurano
Kimwipes Limpadores descartáveis de baixa fiapo	Kimberly Clark- Kimwipes	Z188964
Purê de ração de rato
Meloxicam (METACAM)
Cone			do narizFeito de um tubo
PAA ocular lubricant (Carbomer 2mg/g)	Bausch and lomb
Povidone-iodine solution		2505692
PPE (luva, máscara, bata, rede de cabelo)
Retractors	Kent Scientific	SURGI-5001
RPMI 1640 Media	ThermoFisher Scientific	11875093
Sutura de seda 13mm 5-0, P3, 45cm	Ethicon	JJ-640G
Solução salina normal estéril	ThermoFisher Scientific	TM4469
Sticky tape
Tábua			Uma tábua de cortar envolta em saco autoclavável.
Tesoura cirúrgica	Proscitech	T104	Dimensões da ponta (LxD): 38x7mm, Comprimento 115mm
Pinça de sutura/ Pinça de brofa curva	Proscitech	T113C	Curva, Arredondada ponta estreita de 2 mm, com serrilhas, comprimento 165 mm
Porta-agulha de sutura (porta-agulha Olsen Hegar)	Proscitech	TC1322-180	comprimento 190 mm, braçadeira de catraca
Chave de seringa com pedal/ UMP3 Ultra microbomba	World Precision Instruments	UMP3-3
T75 frasco de cultura de tecidos	ThermoFisher Scientific	156499
Thread
Trigene II desinfetante de superfícies	Ceva

de dissecçãoelétricos de microcentrífuga cirúrgica