Análise LC-MS/MS do perfil proteômico de grânulos de neuromelanina isolados de tecido cerebral humano

Resumo

Fonte: Wulf, M., et.al. Protocolo baseado em microdissecção a laser para a análise LC-MS/MS do perfil proteômico de grânulos de neuromelanina. J. Vis. Exp. (2021).

Este vídeo demonstra a análise de amostras de peptídeos de grânulos de neuromelanina (NMGs) isolados de tecido cerebral humano post-mortem. Os peptídeos são primeiro separados usando cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e depois analisados por espectrometria de massa para determinar suas razões massa-carga (m/z). Os peptídeos direcionados são fragmentados para identificar modificações pós-traducionais e os dados resultantes são comparados a um banco de dados de referência para determinar o perfil proteômico dos NMGs.

Protocolo

1. Digestão tríptica

1. Descongele as amostras no gelo.
2. Seque completamente as amostras em um concentrador a vácuo.
3. Encha a amostra com 50 μL de um tampão de digestão adequado, por exemplo, 50 mM de bicarbonato de amônio.
4. Após a adição de 1,25 μL de 1,4-ditiotreitol 200 mM, incubar as amostras por 30 min a 60 °C e 300 rpm usando um termomisturador e resfriá-las até a temperatura ambiente (RT) em seguida.
5. Em seguida, incubar amostras em RT por 30 min no escuro após a adição de 1,36 μL 0,55 M de iodoacetamida.
6. Adicione uma quantidade adequada de tripsina às amostras e incube as amostras durante a noite (~ 16 h) a 37 ° C.
NOTA: Para 1.000.000 μm², 0,1 μg de tripsina foi considerado suficiente.
7. Adicione 2,6 μL de ácido trifluoroacético (TFA) a 10% às amostras para interromper a digestão (concentração final de 0,5% de TFA).
8. Seque completamente as amostras usando um concentrador de vácuo. Em seguida, preencha as amostras até um volume final definido com 0,1% de TFA. As amostras de NMG foram preenchidas até 20 μL, das quais 5 μL foram usadas para um experimento de espectrometria de massa (MS).
9. Armazenar as amostras a -80 °C até nova utilização. Determine a concentração de peptídeos por análise de aminoácidos ou outro método de quantificação adequado (por exemplo, Detecção Direta).
NOTA: Quantidades baixas de amostra podem não ser quantificáveis usando as técnicas mencionadas. Para garantir uma carga de amostra idêntica, cada amostra deve conter a mesma quantidade de tecido isolado e cada amostra deve ser tratada igualmente.

2. Cromatografia líquida de alta eficiência e espectrometria de massa

NOTA: As seguintes análises de espectrometria de massa (MS) de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) são otimizadas para o sistema LC específico com um dispositivo de coluna de captura e espectrômetro de massa usados aqui (consulte a Tabela de Materiais). Para outros sistemas LC e MS, recomenda-se a adaptação dos parâmetros.

1. Usando o software Xcalibur, ajuste as configurações de HPLC da seguinte forma.
   1. Coluna Trap: Defina a temperatura para 60 °C, vazão para 30 μL/min, executando o tampão para 0,1% de ácido trifluoroacético.
   2. Coluna analítica de fase reversa C18: Defina a temperatura para 60 °C, vazão para 30 μL/min, o tampão A para ácido trifluoroacético a 0,1%, o tampão B para 84% de acetonitrila e o gradiente para 5%-30% do tampão B durante 98 min.
      NOTA: A adaptação do gradiente pode ser inevitável e é fortemente recomendada ao usar diferentes tecidos ou células. O tempo total do gradiente pode variar devido ao carregamento da amostra no início do gradiente e à lavagem da amostra no final do gradiente. O gradiente total neste protocolo consiste em 7 min de carregamento de amostra e lavagem adicional da coluna por 15 min, resultando em um tempo total de gradiente de 120 min.
2. Crie um método de aquisição dependente de dados (DDA) usando a configuração do instrumento XCalibur, que pode ser encontrada no menu do roteiro do software HPLC.
3. Na guia Parâmetros globais, defina o modo de infusão Cromatografia líquida, a largura de pico de LC esperada (30 s) e o estado de carga padrão (2).
4. Prossiga para a guia Parâmetros de varredura e adicione as seguintes varreduras e filtros na ordem mencionada: MS OT, MIPS, Intensidade, Estado de carga, Exclusão dinâmica e ddMS2 OT HCD.
   As configurações ideais de MS e DDA podem variar para o espectrômetro de massa específico usado, bem como para o tipo de amostra e, portanto, devem ser adaptadas.
5. Prepare amostras dissolvendo 200-400 ng de peptídeos de amostra em um volume definido de 0,1% de TFA em entradas de frascos de vidro de espectrometria de massa inerte. Se a determinação da concentração não for aplicável devido à baixa quantidade de amostra, verifique o carregamento idêntico da amostra comparando a corrente de íons total (TIC).
   NOTA: Para fazer isso, abra o arquivo resultante de medição por espectrometria de massa em um software adequado, por exemplo, FreeStyle, e verifique o cromatograma. As intensidades devem ser comparáveis para todas as amostras. Uma TIC representativa é mostrada na Figura 1.
6. Analise os dados brutos obtidos usando um software proteômico adequado, por exemplo, MaxQuant, Progenesis QI for Proteomics ou Proteome Discoverer, e realize uma análise estatística de dados com base na questão de pesquisa.

3. Análise de dados brutos proteômicos usando MaxQuant

1. Carregue arquivos brutos no software MaxQuant no cabeçalho de dados brutos clicando em Carregar.
2. Atribua nomes de amostra clicando em Definir experimento.
3. Defina parâmetros específicos do grupo. Primeiro, adicione modificações. Devido ao processamento da amostra, escolha Deamidação (NQ), Oxidação (M) e Carbamidometilação (N-termo) como modificações variáveis e adicione Carbamidometilação (C) como modificação fixa.
4. Escolha Tripsina como enzima de digestão na guia Digestão.
5. Adicione a opção de quantificação sem rótulo LFQ na guia Quantificação sem rótulo. Se mais de 10 arquivos forem processados, escolha a opção Fast LFQ para reduzir o tempo de processamento. Adicione a opção iBAQ como uma medida para quantificação de proteínas.
6. Certifique-se de que todos os outros parâmetros específicos do grupo permaneçam nas configurações de fábrica.
7. Prossiga para a guia Parâmetros globais e adicione o arquivo FASTA derivado de uniprot.org na guia Sequências. Modifique a regra do identificador de acordo e adicione o ID da taxonomia, neste caso, 9606 para homo sapiens.
8. Para quantificação de proteínas, escolha os peptídeos Unique e Razor.
9. Certifique-se de que todos os outros parâmetros globais permaneçam nas configurações de fábrica.
10. Clique em Iniciar e recupere a saída proteingroups.txt após a análise MaxQuant para análise posterior no Perseus.

Resultados

Figura 1: Corrente de íons total (TIC) de uma medição DDA de 120 min. O cromatograma mostra a abundância relativa dos íons correspondentes aos peptídeos eluidores ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1,4-dithiothreitol	AppliChem	A1101
Acetonitrile	Merck	1.00029.2500
Ammonium bicarbonate	Sigma-Aldrich	A6141
Formic acid	Sigma-Aldrich	56302
Iodoacetamida	AppliChem	A1666,0100
Micro Tube 500	Carl Zeiss	415190-9221-000<
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer	Thermo Fisher Scientific	IQLAAEGAAPFADBMBHQ
PALM MicroBeam	Zeiss	494800-0014-000
Trifluoroacetic	Merck	91707
Trypsin sequencing grade	Serva	37283.01
Ultimate 3000 RSLC nano LC system	Thermo Fisher Scientific	ULTIM3000RSLCNANO
Nome do Software	Weblink/Company	Version
FreeStyle	Thermo Fisher Scientific	1.6
MaxQuant	https://www.maxquant.org/	1.6.17.0
PALMRobo	Zeiss	4.6 pro
Perseus	https://www.maxquant.org/perseus/	1.6.15.0
Skyline	https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view	20.2.0.343
XCalibur	Thermo Fisher Scientific	4.3

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