Imagem baseada em imunocitoquímica para visualização da migração de células de glioma pediátrico

Resumo

Fonte: Pericoli, G. et. al., Ensaios de imunocitoquímica de células 3D vivas de glioma de linha média difusa pediátrica. J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo demonstra imagens de células vivas para observar a migração de células de glioma de linha média difusa pediátrica usando marcação imuno-histoquímica com anticorpos anti-CD44.

Protocolo

1. Geração de esferoides tumorais de tamanho reprodutível

1. Colete as neuroesferas (NS) mutantes H3K27M do Diffuse Midline Glioma (DMG) e centrifugue em 170 x g por 10 minutos (min) à temperatura ambiente (RT).
2. Para quebrar o SN, incube 500 μL da solução de accutase por 3 min a 37 ° C.
3. Neutralize a solução de accutase com células style='font-family:Roboto,sans-serif;font-size:9pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>7 e centrifugue o suspensão de célula em 355 x g por 5 min em RT.
4. Ressuspenda o pellet celular em 1 mL de meio TSM e, em seguida, conte as células usando uma câmara de contagem de células.
5. Dilua a suspensão da célula para obter 2,5-5 x 10³ células/mL e semear 100 μL/poço em placas de fundo redondo de 96 poços de fixação ultrabaixa (ULA) (consulte Table of Materials). Use uma densidade celular adequada para obter NS individual de ~ 300 μm de diâmetro, 4 dias após a semeadura celular (250-500 células / poço para células de glioma altamente agressivas).
6. Confirme visualmente a formação de NS usando um microscópio invertido 4 dias após a semeadura celular.

2. Preparação do reagente de marcação de anticorpos (ALR)/complexo de anticorpos e configuração para o ensaio de migração

1. Considere o número de poços para analisar e calcular o volume necessário para cada reagente. Incluir também os poços necessários para os controlos negativos. Verifique o NS visualmente usando um microscópio invertido antes de iniciar.
2. Use placas de fundo plano de 96 poços. Execute o revestimento. Para este estudo, a matriz de membrana basal (BMM) é usada como um revestimento fino.
3. Quando o revestimento estiver pronto, remova o excesso de revestimento BMM com uma ponta p200, colocando a ponta na borda do poço e evitando tocar no fundo. Se estiver trabalhando com vários poços, use uma pipeta multicanal.
4. Corte uma ponta p200, pegue 50 μL do meio celular + NS de cada poço selecionado e transfira-o para um poço de fundo plano revestido. Verifique visualmente a presença e a posição do NS em cada poço.
   NOTA: Cada NS deve estar localizado centralmente no poço. Evite apoiar-se na ponta na borda do poço durante a transferência, mas solte o meio centralmente no poço sem tocar no fundo. Para células altamente migratórias, considere um número maior de réplicas do que as três réplicas padrão. Isso ocorre porque, quando o NS fica muito perto da borda do poço, as células migratórias podem cobrir uma área menor do poço.
5. Adicione 100 μL de água estéril ao ALR para reidratar o reagente (concentração final = 0,5 mg/mL). Pipeta para misturar a solução. NOTA: O reagente é sensível à luz; portanto, mantenha-se no escuro. Aliquotar o reagente restante e conservar a -80 °C (evitar congelar e descongelar).
6. Misture o anticorpo com ALR no meio de crescimento celular completo apropriado em uma placa de fundo redondo de vários poços ou em um tubo âmbar e proteja da luz. Prepare quantidade suficiente para dispensar 50 μL/poço na concentração final do ensaio 3x. Incubar em RT por 15 min.
7. Diluir o reagente supressor de fundo (BSR) em meio TSM (ou meio de crescimento celular apropriado para a linhagem celular de escolha) a 1,5 mM (3x) para obter no final do ensaio uma concentração final de 0,5 mM.
   NOTE:<span style='font-family:Roboto,sans-serif; tamanho da fonte:12pt; estilo da fonte:normal; variante de fonte: normal; peso da fonte: 400; decoração de texto:nenhuma; alinhamento vertical:linha de base; espaço em branco: pré-encapsulamento;' > Reagente é sensível à luz. Veja acima os bons procedimentos de manuseio.
8. Adicione suavemente 50 μL de BSR a cada poço.
9. Adicione suavemente 50 μL de ALR/anticorpo a cada poço. Aguarde 2 ou 3 minutos para que os reagentes se misturem e verifique visualmente usando um microscópio invertido para garantir que a maioria dos NS replicados esteja localizada centralmente no poço.
10. Evite a formação de bolhas e remova as existentes usando uma agulha. Transfira suavemente a placa no instrumento de análise de células vivas colocado dentro da incubadora a 37 °C, 5% CO₂, 95% de umidade.

3. Configuração do instrumento de análise de células vivas para aquisição de imagens

1. Digitalize as placas usando o instrumento de análise de células vivas (para especificações, consulte Tabela de Materiais) com intervalos de varredura a partir do ponto de tempo zero (t0) dos ensaios de invasão e migração configurados, respectivamente, após a etapa 2.14. e 3.10. até 96 h.
   NOTE:<span style='font-family:Roboto,sans-serif; tamanho da fonte:12pt; estilo da fonte:normal; variante de fonte: normal; peso da fonte: 400; decoração de texto:nenhuma; alinhamento vertical:linha de base; espaço em branco: pré-encapsulamento;' > Garantir a capacidade de descartar o instrumento de análise de células vivas imediatamente após o início do ensaio de invasão e migração. Dependendo do tipo de tumor, as células podem começar a invadir ou migrar do SN já dentro de 1 h após a configuração do ensaio.
2. No software do instrumento de análise de células vivas, selecione a opção Schedule to Acquire. Clique no + guia e selecione a opção Scan on Schedule.
3. Na janela do software Create or Restore Vessel, clique na opção New.
4. Selecione a aplicação específica no instrumento de análise de células vivas para a aquisição de invasão e migração. Selecione Spheroid scan type, 4x objective, Phase+Brightfield e Green canais de imagem para o ensaio de invasão. Selecione Dilution Cloning tipo de varredura, objetivo 4x e Phase and Green para o ensaio de migração.
5. Selecione o tipo de placa e defina os poços a serem escaneados, destacando-os no mapa de placas.
6. Configure a frequência de varredura (para os experimentos neste protocolo, a frequência de varredura foi de 15 min para invasão e 30 min para migração).
7. Clique em Add to Schedule e inicie a verificação.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
96 Well TC-Treated Microplates<	3595	Size 96 poços, placa de poliestireno, fundo plano
Accutase	Euroclone	ECB3056D	Solução para dissociação da neuroesfera
Burker chamber	Mv medical	FFL16034	Cell counting chamber
CD-44 (156-3C11)	Cell Signaling Technology	3570	Mouse mAb IgG2a
Corning Matrigel Matrix	Corning	356237	Basement Membrane Matrix (BMM), sem vermelho de fenol, sem
Fabfluor-488 Corante de rotulagem de anticorpos	Incucyte	4743	Reagente de marcação de anticorpos (ALR): Anticorpo IgG2a 488 de camundongo para imunocitoquímica
Incucyte S3 e/ou SX5 Live-Cell Analysis Instrument	Sartorius	-	O instrumento Incucyte S3 e/ou SX5 é usado para monitoramento e vigilância celular em tempo real, saúde e viabilidade celular, migração e invasão, além de uma ampla gama de ensaios fenotípicos baseados em células.
Inverted Microscope		-	Any inverted microscope
Opti-Green Background Suppressor Reagent	Incucyte	6500-0045	Backgroung reagente supressor (BSR)
Tumor stem cell (TSM) medium	-	-	Growth cell medium (ver referência no texto para detalhes)

td style='width:122pt;'>Corning LDEV de células vivas