Separação de Single-stranded DNA, Double-stranded DNA e RNA de uma Comunidade Ambiental Viral Usando Cromatografia hidroxiapatita

Resumo

Nós descrevemos um método eficiente para separar single-stranded DNA, dupla fita de DNA e RNA de moléculas ambientais comunidades viral. Os ácidos nucleicos são fracionados por cromatografia em fase de hidroxiapatita com concentrações crescentes de fosfato contendo buffers. Este método permite o isolamento de todos os tipos de ácido nucléico viral a partir de amostras ambientais.

Resumo

Vírus, especialmente os bacteriófagos (fagos), são as entidades mais numerosas biológica em ^1,2 Terra. Vírus da célula hospedeira modular a abundância e diversidade, contribuem para a ciclagem de nutrientes, alterar anfitrião fenótipo celular, e influenciar a evolução de ambas as células do hospedeiro e as comunidades viral através da transferência lateral de genes ^3. Numerosos estudos têm destacado a diversidade genética impressionante de vírus e seu potencial funcional em uma variedade de ambientes naturais.

Metagenomic técnicas têm sido usadas para estudar a diversidade taxonômica e potencial funcional do complexo assemblages viral cujos membros contêm DNA de fita simples (ssDNA), double-stranded DNA (dsDNA) e genótipos RNA ^4-9. Protocolos biblioteca atual de construção usado para estudo de DNA contendo ambientais ou RNA contendo vírus requerem um tratamento nuclease inicial, a fim de remover os modelos não-alvo ^10. No entanto, uma compreensão abrangente do complemento gene coletiva da comunidade vírus e diversidade de vírus requer o conhecimento de todos os membros, independentemente da composição do genoma. Fracionamento de ácido nucléico purificadas subtipos fornece um mecanismo eficaz pelo qual o estudo assemblages viral sem sacrificar um subconjunto de assinatura genética da comunidade.

Hidroxiapatita, uma forma cristalina de fosfato de cálcio, tem sido empregada na separação de ácidos nucléicos, bem como proteínas e micróbios, desde os anos 1960 ^11. Ao explorar a interação entre o Ca carga com carga positiva ^{2 +} íons da hidroxiapatita e da espinha dorsal de fosfato carregados negativamente dos subtipos de ácido nucléico, é possível eluir preferencialmente cada subtipo de ácido nucléico independente dos outros. Recentemente, esta estratégia empregada de forma independente fracionar os genomas de ssDNA, dsDNA e RNA-vírus que contenham em preparação de seqüenciamento de DNA ^12. Aqui, apresentamos um método para o fracionamento e recuperação de ácidos viral ssDNA, dsDNA e RNA nucleico de misturado assemblages viral utilizando cromatografia de hidroxiapatita.

Protocolo

1. Preparação de soluções

Antes de realizar a cromatografia de hidroxiapatita, fosfato de buffers deve ser preparado e da hidroxiapatita deve ser adequadamente hidratado.

1. Solução fosfato 1M, pH 6.8: Em um frasco 1L dissolver 119.98g de fosfato de sódio monobásico em 1L de estéril, DEPC tratados com H ₂ O. Prepare uma solução de fosfato de sódio 1M dibásico em um frasco 1L, dissolvendo 141.96g de fosfato de sódio dibásico em 1L de estéril, DEPC tratados com H ₂ O. Combine o mono-e di-soluções na proporção de 1:1. Frasco lugar em uma placa mexa e misture usando uma barra de agitação magnética. Ajustar o pH p....

Discussão

A metodologia de cromatografia de hidroxiapatita apresentado aqui é uma ferramenta altamente eficiente e robusto para o fracionamento de ácidos nucléicos a partir de conjuntos mistos viral, quando o objetivo é estudar a composição de ácidos nucléicos totais da comunidade. Geralmente, ssDNA, RNA e dsDNA vai saem da coluna pho concentrações de fosfato tampão maior que cerca de 0,40 m ~ 0and respectivamente. No entanto, cada preparação de hidroxiapatita pode ter uma composição ligeiramente diferente eo perfil de e.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do material	Companhia	Número Catálogo	Número Catálogo
Coluna Econo-	Bio-Rad	737-0717	0,7 centímetros pacote de ID / 2
Hidroxiapatita	Bio-Rad	130-0520	DNA Grade Bio-Gel Gel HTP, 100g/td>
Fosfato de sódio monobásico	VWR	VW1497-01	Monohidratada, Crystal 500g
Fosfato de sódio dibásico	VWR	VW1496-01	Anidro, em pó 500g
DEPC tratados com água	Invitrogen	AM9922	1L
10% da solução SDS	Invitrogen	24730-020	UltraPure, 1L
EDTA 0.5M	Invitrogen	AM9262	pH 8,0, 1L
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2-25ML
2ml sorológicos pippette	VWR	89130-884	Poliestireno, estéril
Centrífuga BD Tubos Falcon	VWR	21008-936	15ml, estéril
Fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25:24:1 v / v / v)	Invitrogen	15593-031	UltraPure, 100ml
Amicon Dispositivo Ultra-4 Centrífuga	Millipore	UFC803024	Ultracel-30 membrana
20X TE Buffer, Rnase livre	Invitrogen	T11493	100ml
Glycoblue	Invitrogen	AM9516	15mg/ml