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1. Coleta de tumor neuroendócrino do intestino delgado (SBNET) e dissociação
- celularObtenha amostras SBNET de pacientes ressecadas após a confirmação do tecido tumoral do Surgical Pathology Core.
- Corte os SBNETs em cubos de 5 mm e armazene-os em 25 mL de meio Eagle Modificado (DMEM)/F12 da Dulbecco em um tubo cônico para transporte para o laboratório.
- Transfira os tumores para DMEM contendo 1% de soro fetal bovino ou FBS, 1% de penicilina/estreptomicina (Pen/Strep) e 1% de glutamina (Wash Medium) e incube neste Wash Medium por 15 min.
- Transfira os tumores para um novo prato e pique-os em pedaços com menos de 1 mm de diâmetro usando uma tesoura curva estéril.
- Transfira os tecidos picados para um novo tubo de 50 mL contendo 25 mL de meio de lavagem.
- Centrifugue a amostra a 500 x g por 15 min a 4 °C.
- Descarte o sobrenadante e ressuspenda os pellets em 10 mL de Wash Medium contendo colagenase (100 U/mL) e DNase (0,1 mg/mL).
- Permite que os tumores picados sejam digeridos em uma incubadora a 37 °C com agitação lenta (50 rpm) por 1,5 h.
2. Cultura de SBNETs como esferóides tumorais em Matriz Extra Celular (ECM)
- Após a conclusão da digestão (etapa 1.8), centrifugue a 500 x g por 15 min a 4 °C, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 15 mL de meio de lavagem.
- Coloque um filtro de células de 70 μm em cima de um novo tubo de 50 mL e transfira 10 mL do meio de lavagem sobre o filtro de células. Gire o meio de lavagem para cobrir a lateral do tubo de plástico para evitar que as células NET grudem na lateral do tubo de plástico.
- Filtre a suspensão da célula por meio de um filtro de célula.
- Centrifugue a 500 x g por 15 min a 4 °C, descarte o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 200 μL de meio de lavagem (o volume total é ~ 250 μL) e coloque-o no gelo.
- Transfira 5 μL de células para 500 μL de meio de lavagem (fator de diluição de 1/100). Use as células diluídas para contagem de células usando um hemocitômetro para obter o número de células por mililitro. Multiplique por 100 para corrigir o fator de diluição.
- Multiplique o número de células por mL obtido na etapa 2.5 pelo volume total de células em suspensão obtido na etapa 2.4 (~ 250 μL).
- Centrifugue a 500 x g por 15 min a 4 °C, descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em ECM líquido (1 x 106 células/mL) e mantenha em gelo.
- Transfira 5-20 μL de esferoides SBNET em ECM para uma placa de 96 poços e permita que o ECM líquido solidifique colocando a placa em uma incubadora a 37 °C por 5 min.
- Adicione 200 μL de meio de cultura SBNET (DMEM/F12 + 10% FBS + 1% PEN/STREP + 1% Glutamina + 10 mM de nicotinamida + 10 μg/mL de insulina) a cada poço da placa de 96 poços contendo os esferoides SBNET na ECM.
- Alternativamente, cultive organoides SBNET em meio de células-tronco semelhante ao que foi descrito anteriormente para o cultivo de organoides hepáticos humanos ou pancreáticos e listados na Tabela de Materiais.
- Altere a mídia a cada 5-7 dias.
3. Caracterização de esferoides SBNETS por imunofluorescência
- Transfira os organoides cultivados em ECM para um tubo de 1,5 mL usando uma pipeta P1000.
- Centrifugue a 1.500 x g por 1 min e remova o sobrenadante.
- Lave a cultura organoide adicionando 1 mL de tampão fosfato salino ou PBS, misture, centrifugue a 1.500 x g por 1 min e remova o sobrenadante.
- Fixe os organoides adicionando 500 μL de paraformaldeído a 4% e incube por 15 min.
- Lave a cultura duas vezes com 1 mL de PBS.
- Permeabilize a cultura adicionando 500 μL de PBS + 3% de albumina de soro bovino ou BSA + 0,1% de Triton X 100 por 5 min.
- Em seguida, lave três vezes com 1 mL de PBS + 3% de BSA.
- Incubar por 1 h com anticorpos primários contra sinaptofisina (SYP) na diluição de 1/600 ou cromogranina A (CgA) e receptor de somatostatina 2 (SSTR2) na diluição de 1/400 em tampão de anticorpo (albumina de soro bovino a 2,5%, azida de sódio a 0,1%, Tris pH 7,4 mM de 25 mM, cloreto de sódio a 150 mM).
NOTA: Use 300 μL ou mais de solução de anticorpos por tubo. - Lave três vezes com 1 mL de PBS + 3% de BSA.
- Incubar com anticorpos secundários acoplados a FITC em diluição de 1/500 em tampão de anticorpos por 1 h. Use 300 μL ou mais de solução de anticorpos por tubo.
- Lave 3 vezes com 1 mL de PBS + 3% de BSA. Certifique-se de aspirar e descartar todo o sobrenadante.
- Adicione 5 μL de meio de montagem contendo a coloração nuclear DAPI.
- Use uma pipeta P20 para transferir 5 μL dos esferoides SBNET da etapa 4.12 para uma lâmina de vidro e selar com uma lamínula.
- Tire imagens usando um microscópio fluorescente usando as objetivas de 10x, 20x ou 40x.