Medição da taxa de consumo de oxigênio em fatias agudas de cérebro de camundongo

Resumo

Fonte: Zhi, L. et al., Medição da Taxa de Consumo de Oxigênio em Fatias Estriatais Agudas de Camundongos Adultos. J. Vis. Exp. (2022).

Este vídeo demonstra como medir a taxa de consumo de oxigênio mitocondrial (OCR) em fatias de cérebro estriado de camundongos. Ele detalha as etapas para preparar a placa de tecido e o cartucho do sensor, carregá-los no analisador de fluxo e explica os processos celulares subjacentes aos padrões de OCR.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Sensores de cartucho de hidrato (1 dia antes do ensaio)

1. Abra o kit de ensaio de fluxo extracelular (consulte a Tabela de Materiais) e remova o cartucho do sensor (verde) e a placa de utilidade (transparente; Figura 1A). Coloque o cartucho do sensor de lado (sensores para cima) e não toque nos sensores.
2. Adicione 600 μL de solução calibrante (pH 7,4) a cada poço da placa de utilidade. Coloque o cartucho do sensor em cima da placa de utilidades e mergulhe os sensores na solução calibrante. Certifique-se de que o entalhe triangular do utilitário e a placa do cartucho do sensor estejam alinhados corretamente (Figura 1B).
3. Sele o kit de ensaio de fluxo extracelular com filme de vedação para evitar a evaporação da solução calibrante e, em seguida, coloque-o em uma incubadora a 37 °C não suplementada com CO₂ ou oxigênio durante a noite.

2. Prepare a placa de tecido (no dia do ensaio)

1. Abra a microplaca de captura de ilhotas e retire a placa de ilhota para assentamento de tecido.
2. Aqueça um volume apropriado (625 μL por poço) de líquido cefalorraquidiano artificial modificado pré-oxigenado (ACSF, composição 140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2,4 mM CaCl₂, 1,3 mM MgSO₄, 0,3 mM KH₂PO₄, 25 mM glicose, 10 mM HEPES, pH 7,2) tampão a 37 °C em um tubo de 50 mL. Em seguida, adicione BSA a uma concentração final de 4 mg / mL para preparar o tampão respiratório. Em geral, 50 mL são suficientes para uma placa.
3. Adicione 625 μL de tampão respiratório (tampão ACSF pré-oxigenado com 25 mM de glicose e 4 mg/mL de BSA) a cada poço da placa da ilhota com cuidado e evite agitar a placa. Certifique-se de que não haja gotas residuais em cima do cartucho do sensor e que não haja bolhas de ar no tampão de cada poço.

3. Preparação aguda do corte estriatal e colocação

1. do corte excisadoDecapite o camundongo após luxação cervical e disseque imediatamente o cérebro em 10 mL de solução de corte pré-oxigenada gelada (125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO₃, 3,7 mM MgSO₄, 0,3 mM KH₂PO₄, 10 mM de glicose, pH 7,4).
2. Corte cortes estriatais coronais com um vibratomo seguindo as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais) com uma espessura de 150 μm em solução de corte pré-oxigenada gelada.
3. Recupere as fatias em 50 mL de ACSF oxigenado (125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO₃, 2,4 mM CaCl₂, 1,3 mM MgSO₄, 0,3 mM KH₂PO₄, 10 mM de glicose, 2 mM HEPES, pH 7,4) e mantenha em solução por até 30 min em temperatura ambiente (RT).
4. Após a recuperação, transfira as fatias para uma placa de Petri de 35 mm x 10 mm com 5 mL de tampão respiratório.
5. Use um punção de biópsia de aço inoxidável (por exemplo, 1,5 mm de diâmetro) para criar um pedaço circular de tecido na área desejada do cérebro fatiado. Mantenha a fatia no tampão enquanto pressiona suavemente com o soco. Certifique-se de que o punção seja empurrado para baixo com força suficiente para cortar o tecido. Remova o resto do tecido, levante o punção e remova o pedaço circular de tecido no tampão.
6. Corte a extremidade de uma ponta de pipeta de 1 mL para fazer um orifício com 1,5-2,0 mm de diâmetro e use-a para segurar e transferir a fatia perfurada para a parte superior da tela de captura. Sugue um pedaço de tecido cerebral perfurado e coloque cuidadosamente o tecido no lado da malha da tela de captura (Figura 2A). A tela de captura será um pedaço circular de plástico com a malha presa a um lado.
   NOTA: As telas de captura estão incluídas no pacote de microplacas (consulte a Tabela de Materiais).
7. Use suavemente um lenço de papel para secar a tela de captura brevemente. Com a umidade removida, o tecido fica pegajoso, o que permite que a fatia se prenda ao centro da malha. Não seque muito a fatia, caso contrário, ela será danificada.
8. Segure a tela de captura com o lado da fatia voltado para baixo com uma pinça e coloque-a em um dos poços da placa da ilhota de incubação (Figura 2B). Tenha cuidado para não deixar cair a fatia; Em caso afirmativo, retire a tela e coloque uma nova fatia nela.
   NOTA: Não coloque fatias de cérebro nos dois poços de correção de fundo (A1 e D6) na placa da ilhota.
9. Incube a placa das ilhotas a 37 °C em uma incubadora por pelo menos 30 min para permitir o equilíbrio da temperatura e do pH antes de executar o ensaio.

4. Carregamento de cartuchos com os compostos desejados

1. Dilua os compostos desejados em ACSF modificado (37 °C) até a concentração final de estoque de 10x, 11x, 12x e 13x da concentração de trabalho para as portas A a D, respectivamente, e ajuste para pH 7,4. O teste administrará os compostos em ordem da porta A a D. Para este experimento, foram utilizadas as seguintes soluções, com suas respectivas concentrações de trabalho mencionadas anteriormente: 10 mM de piruvato (porta A), 20 μM de oligomicina (porta B), 10 μM ou outras concentrações de carbonilcianeto 4-(trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP) (porta C) e 20 μM de antimicina A (porta D).
2. Pré-carregue suavemente 75 μL dos compostos diluídos nas portas de injeção apropriadas do cartucho do sensor. Coloque as pontas até a metade das portas de injeção em um ângulo de 45° com a ponta contra a parede da porta de injeção. As pontas não devem ser inseridas completamente na parte inferior das portas de injeção, pois isso pode causar vazamento de composto pela porta.
3. Retire as pontas das portas com cuidado para evitar a criação de bolhas de ar. Não bata em nenhuma parte do cartucho para evitar aliviar as bolhas de ar.
4. Inspecione visualmente as portas de injeção para ver se há carregamento uniforme. Certifique-se de que todo o líquido esteja na porta e que nenhuma gota residual esteja presente na parte superior do cartucho.
5. Coloque o cartucho do sensor na placa de utilidades e coloque-o em uma incubadora (não-CO₂) por 30 min para permitir que aqueça até 37 °C novamente. Manuseie com cuidado, segurando apenas a placa de utilidades. Mova-se o mínimo possível.

5. Calibração e execução do ensaio

1. Carregue o modelo de ensaio no software. Pressione o botão verde START.
2. Certifique-se de carregar o protocolo correto. O protocolo contém uma combinação de sequências de 3 minutos de mixagem, 3 minutos de espera e 2 minutos de medição (essas três etapas formam uma medição). Altere a distância do cabeçote da sonda de 26.600 para 27.800 nas configurações de hardware nas configurações do instrumento. Não há necessidade de trocar o cabeçote da sonda para o analisador XFe24. Pressione START.
3. Carregue o cartucho do sensor na placa de utilidades na bandeja do instrumento. O entalhe vai no canto frontal esquerdo. Certifique-se de que a placa esteja corretamente encaixada e plana. Carregue o cartucho do sensor cheio de drogas no analisador para calibração.
4. Siga as instruções na tela para calibrar e equilibrar os sensores. Isso leva cerca de 30 minutos.
5. Assim que a etapa de calibração estiver concluída, remova a placa de calibração e substitua-a pela placa da ilhota (contendo a malha e as fatias de tecido).
6. Meça o consumo de oxigênio em cada poço da placa usando os protocolos de ensaio. O protocolo contém uma combinação de sequências de mistura de 3 minutos, espera de 3 minutos e medição de 2 minutos (essas três etapas formam uma medição), ponto em que a taxa de consumo de oxigênio (OCR) é calculada.
7. Para todo o experimento, inclua 4x medições de OCR para criar uma linha de base, seguida pela injeção da porta A (piruvato) com 4x medições, depois a injeção da porta B (oligomicina) com 8x medições, depois a injeção da porta C (FCCP) com 5x medições e, finalmente, a injeção da porta D (antimicina A) com 6x medições.
   NOTA: Este número de medições após cada injeção de composto é determinado dependendo de quando a medição atinge o platô.
8. Analise os dados de medição de OCR e os dados de eficiência de acoplamento.

Resultados

Figura 1: Imagens mostrando os sensores e a placa do cartucho de hidrato do analisador de fluxo extracelular. (A) O cartucho do sensor em cima de uma placa de calibração (placa de utilidade). (B) Vista lateral da placa d...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Accumet AB150 medidor de bancada de pH	Thermo Fisher Scientific	13-636-AB150	Para medir pH
Antimicina A de Streptomyces sp.	SIGMA	A8674	Para inibir o complexo III das mitocôndrias
Albumina de soro bovino (BSA)	SIGMA	A6003	Para fazer líquido cefalorraquidiano artificial modificado (BSA-ACSF)
Cianeto de carbonila 4-( trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP)	SIGMA	C2920	Para desacoplar a respiração mitocondrial
D-Glucose	SIGMA	G8270	Para fazer líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF)
DMSO	SIGMA	D8418	To dissolver compostos
HEPES	SIGMA	H3375	To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF)
Humidified non-carbon dioxide incubator	Fisher Scientific	11-683-230D	Para hidratar placas a 37 °
Oligomicina de Streptomyces diastatochromogenes	SIGMA	O4876	Para inibir a ATP sintase mitocondrial
Parafilm	SIGMA-ALDRICH		sealing film
Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL	Seahorse Bioscience	103681-100	Solução para calibração de cavalos-marinhos
Seahorse XF Extracellular Flux Analyzer	Seahorse Bioscience		Equipamento usado para analisar a taxa de consumo de oxigênio, old generation
Seahorse Analisador de Fluxo Extracelular XFe24	Seahorse Bioscience		Equipamento usado para analisar a taxa de consumo de oxigênio, nova geração
Seahorse XF24 FluxPaks	Seahorse Bioscience	101174-100	Pacote de cartuchos de sensor de analisador de fluxo, placas de cultura de tecidos, telas de captura, solução calibrante e placas de calibração; kit de ensaio.
Sodium pyruvate	SIGMA	P2256<
Punções de biópsia de aço inoxidável	Miltex		Dispositivo usado para perfurar fatias
Placa de cultura de células estéreis, 35 x 10 mm	Eppendrof	30700102	Usado para slice punch
Vibratome	Leica	VT1200	Para fatiar o tecido cerebral
Banho-maria	Thermo Scientific Precision	282-115	Para aquecer buffer e soluções

Ctd style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>Para evitar quaisquer restrições limitantes de substrato de fornecimento de substrato