Gerando um modelo de rato de transposição de neuroma tibial

Resumo

Fonte: Brakkee, E. M., et al. Cirurgia e Teste Comportamental no Modelo de Transposição do Neuroma Tibial em Ratos. J. Vis. Exp. (2023).

Este vídeo demonstra um procedimento para gerar um modelo de transposição de neuroma tibial de rato (TNT). Depois de expor o nervo tibial na perna traseira de um rato anestesiado, faça o transeccionamento do nervo. Em seguida, crie um túnel subcutâneo, passe o nervo cortado pelo túnel e suture-o no lugar. Na ausência de um alvo para reinervação, as conseqüências axonais desorganizadas do nervo cortado formam um neuroma, que desencadeia a dor neuropática ao excitar os nociceptores.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Anestesia e preparação

NOTA: Este estudo foi realizado em 15 ratos Sprague Dawley machos com 12 semanas de idade.

1. Anestesiar os animais por indução com isoflurano a 5% e manter a anestesia com isoflurano a 2%-3%.
   NOTA: A manutenção com isoflurano a 2% geralmente resulta em anestesia suficiente e respiração espontânea, sem a necessidade de intubação traqueal ou ventilação mecânica.
2. Verifique os reflexos dos animais beliscando o pé com uma pinça. Certifique-se de que o animal não responda antes de prosseguir. Depile o campo operatório do joelho ao tornozelo com um barbeador elétrico e aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar o ressecamento. Injete 0,5 mg/kg de carprofeno analgésico por via subcutânea na região abdominal.
3. Coloque o rato anestesiado de costas com a cabeça para a esquerda ou para a direita e a perna a ser operada perto do cirurgião. Exorote o membro posterior inferior de modo que o maléolo medial fique voltado para cima. Coloque o rato sob um microscópio cirúrgico estéreo com ampliação de 6x.
4. Desinfete a área raspada com três rodadas alternadas de esfoliante à base de iodo seguidas de álcool. Coloque uma folha estéril com um orifício operatório sobre a perna, de modo que apenas o campo operatório seja visível. Certifique-se de manter essas condições estéreis durante a cirurgia.

2. Surgery

1. Coloque um pequeno cotonete abaixo do tornozelo para manter o campo operatório na horizontal. Localize o joelho e faça suavemente uma incisão longitudinal de 1-2 cm usando um bisturi sobre o lado medial da pata traseira, do meio da panturrilha ao tornozelo. Se necessário, abra ainda mais a pele e a subcutânea com uma microtesoura até que as camadas musculares fiquem visíveis.
2. Identifique o feixe neurovascular superficial como dois ou três brancos e uma linha roxa/vermelha mais espessa, às vezes com ramos menores, que podem se mover livremente sobre as camadas musculares. Usando um eletrocautério (consulte a Tabela de Materiais), coagule qualquer sangramento ativo ou exsudação no campo operatório. Tenha cuidado para não danificar o feixe neurovascular.
3. Disseca sem rodeios para abrir a fáscia entre os músculos gastrocnêmios, logo posterior ao feixe neurovascular superficial de 2.2. Entre a fáscia dos músculos, o nervo tibial pode ser encontrado. O nervo tibial tem cerca de três vezes o tamanho do nervo superficial no feixe neurovascular. Use o osso tibial como um ponto de referência adicional (o nervo tibial fica logo posterior ao osso tibial).
4. Identifique o nervo tibial e sua bifurcação.
   NOTA: A bifurcação é geralmente visível com uma linha mais clara longitudinalmente sobre o nervo.
5. Disseca cuidadosamente o nervo tibial livre dos feixes vasculares circundantes. Realize a dissecção movendo sem rodeios o nervo tibial e cortando o tecido exposto que mostra algum alongamento enquanto move o nervo tibial.
   NOTA: Se o nervo tibial estiver ligado às veias cruzadas após a dissecção, essas veias podem ser coaguladas para expor todo o nervo tibial. Tenha cuidado para não coagular o próprio feixe tibial.
6. Exponha o nervo tibial proximalmente até que ele desapareça sob uma camada muscular cruzada. Nesse ponto, o nervo tibial parece mergulhar mais profundamente na pata traseira em direção ao joelho. Exponha o nervo tibial distalmente até o tornozelo.
   NOTA: Quando o nervo tibial é exposto mais distalmente, a quantidade de fibras colágenas cruzadas (ou seja, fibras perpendiculares à direção das fibras nervosas) aumentará. Essas fibras colágenas precisam ser cortadas para permitir comprimento suficiente para transpor o nervo tibial.
   1. Quando todo o nervo tibial estiver exposto, coloque as camadas musculares para trás para evitar a desidratação do nervo. Se o nervo desidratar (ou seja, ficar mais rígido, opaco e enrugado) e cobrir com camadas musculares não for suficiente, adicione gotas de solução salina para hidratá-lo.
7. Usando uma ferramenta de microcirurgia romba, de preferência um porta-microagulha, disseque a pele pré-tibial da camada muscular subcutânea para fazer um túnel subcutâneo. Para fazer isso, segure a pele para cima e empurre a ponta romba para dentro do tecido, paralela à pele. Certifique-se de que a extremidade do túnel esteja localizada pré-tibialmente ou mais lateralmente para garantir fácil acessibilidade da área para testar o neuroma.
8. Aumente o isoflurano para 5%. Retorne ao nervo tibial e exponha-o (ou seja, volte ao local descrito na etapa 2.6). Corte o nervo tibial (ou seja, ambos os ramos plantares) no nível mais distal próximo ao tornozelo. Diminua o isoflurano para o nível normal de 2% -3%.
9. Altere a ampliação do microscópio para 10x ou 16x. Identifique o epineuro do nervo tibial proximal ao corte feito na etapa 2.8 ou, no caso de uma bifurcação mais proximal do nervo tibial, identifique o epineuro dos ramos plantares medial e lateral proximal ao corte na etapa 2.8.
   NOTA: O epineuro é mais branco e firme em comparação com as fibras nervosas internas, que são mais amarelas e macias.
10. Coloque cuidadosamente um 8-0 sutura de náilon (ver Tabela de Materiais) através do epineuro da extremidade nervosa proximal, segurando cuidadosamente o epineuro com uma pinça e colocando a agulha entre o nervo e o epineuro com uma mordida de aproximadamente 0,5 mm. Puxe a sutura e dê uma mordida com a agulha por via subcutânea no final do túnel subcutâneo feito na etapa 2.7. Faça um nó, que transporá o nervo lateralmente para o túnel subcutâneo.
    NOTA: Se ambos os ramos plantares compartilharem um epineuro comum, uma sutura deve ser suficiente. Se ambos os ramos plantares tiverem seu próprio epineuro, cada epineuro deve ser fixado individualmente. Evite colocar a sutura através da pele; apenas fixe-o por via subcutânea.
11. Coloque uma sutura mais grossa com uma cor escura (de preferência uma sutura 4-0 azul ou preta) rente à extremidade nervosa fixada, não penetrando na pele. Certifique-se de que a sutura seja visível do lado de fora da pele. Verifique se o nervo permanece no lugar depois de mover a pata e os músculos. Corte as extremidades da sutura com uma extremidade de sutura ligeiramente mais longa no 4-0 do que no 8-0 sutura.
12. Altere a ampliação do microscópio de volta para 6x. Feche a pele com suturas intraepidérmicas usando o 8-0 suturar e limpar suavemente a pele com NaCl a 0,9% usando um cotonete.

3. Tratamento pós-cirúrgico

1. Coloque o rato em uma gaiola limpa sob uma toalha de papel em uma posição confortável. Se a sala estiver fria, coloque uma almofada térmica sob uma parte da gaiola (apenas sob uma parte da gaiola, pois o animal deve ser capaz de escapar do calor quando necessário). Garanta fácil acesso a alimentos e água.
2. Não deixe o rato pós-cirúrgico sem vigilância até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. O rato pode ser devolvido à companhia de outros animais quando estiver totalmente recuperado da anestesia após a cirurgia. Isso geralmente ocorre após 1 h e quando o rato exibe seu padrão e comportamento normais de caminhada.
3. Às 24 h e 48 h após a cirurgia, administrar uma dose de 0,5 mg/kg de carprofeno por via subcutânea (região abdominal) para tratar a dor pós-cirúrgica.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Carprofen	Local Veterinary Pharmacy	n/a	A farmácia veterinária local faz diluição
Cotton swabs	Nobamed	974255
Electrocautery	Fine Science Tools	18010-00
Ethanol 70%	Interchema BV	400406
Ethilon 4.0	Johnson & Johnson	1854G	IMPORTANT: a cor deve ser azul ou preta
Ethilon 8.0	Johnson & Johnson	BV130-5
Isoflo, isoflurano Zoetis	Dechra Veterinary Products	B506
Mesh bottom cages	StoeltingCo	57816 e 57824
Micro fórceps	Fine Science Tools	11251-35<
Micro needle holder	Fine Science Tools	12076-12
Micro scissors	Fine Science Tools	15019-10
Micro pinças	Fine Science Tools	11254-20
NaCl 0.9%	Trademed	H7 1000-FRE
Needle holder	Fine Science Tools	12004-16
Pomada oftálmica	Local Veterinary Farmácia	n/a	A farmácia veterinária local faz a pomada
Bisturi	Fine Science Tools	10003-12
Scissors	Fine Science Tools	14001-12
Microscópio cirúrgico estéreo	Leica	A60 F
Folha estéril com furo	Evercare OneMed	1555-01
Lâmina cirúrgica nr.15	Fine Science Tools	10015-00
Tweezers	Fine Science Tools	11617-12

de caprofenotd style='border-left-style:none;border-top-style:none;'> oftálmica