Desenvolvimento de um modelo experimental de aneurisma em um coelho usando uma bolsa de vaso tratada com elastase

Resumo

Fonte: Wanderer, S., et al. Modelo de aneurisma de bifurcação microcirúrgica da bolsa arterial em coelho. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demonstra a criação de um modelo experimental de aneurisma em um coelho usando uma bolsa de vaso tratada com elastase. Após a excisão de um segmento da ACC direita, a bolsa é tratada com elastase e, em seguida, suturada à ACC esquerda para restaurar o fluxo sanguíneo. O estresse resultante nas paredes enfraquecidas da bolsa induz a formação de aneurisma.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

NOTA: Alojar todos os animais a uma temperatura ambiente de 22\u201224 Celsius (°C) e manter um ciclo claro/escuro de 12 horas (h). Forneça acesso gratuito a água, pellets e dieta de feno ad libitum sempre. As análises estatísticas foram realizadas por meio do teste não paramétrico de Wilcoxon-Mann-Whitney-U. Um valor de probabilidade (p) de ≤ 0,05 foi considerado significativo.

1. Fase pré-cirúrgica

1. Realizar um exame clínico pré-operatório detalhado de todos os coelhos planejados para cirurgia imediatamente ao lado de uma sala de cirurgia asséptica silenciosa, mantendo uma temperatura de 23 ± 3 °C.
   1. Registrar macroscopicamente o peso de cada animal e avaliar as membranas mucosas, tempo de enchimento capilar e qualidade do pulso.
   2. Mais adiante, realizar ausculta cardíaca com estetoscópio e palpação abdominal.
   3. Com base nos achados clínicos, atribua uma classificação da American Society of Anesthesiologists (ASA) a cada coelho19. Inclua apenas animais com pontuação ASA I no estudo.
   4. Depile ambas as orelhas externas com um barbeador elétrico e aplique creme de prilocaína-lidocaína nas artérias e veias auriculares.
2. Sedar o coelho com uma combinação de 20 miligramas (mg)/quilograma (kg) de cetamina, 100 mg/kg de dexmedetomidina e 0,3 mg/kg de metadona injetada por via subcutânea (SC) por meio de uma seringa.
3. Deixe cada animal intacto por pelo menos 15 min.
4. Em seguida, sob oxigenação suplementar com 3 litros (l)/minuto (min) através de uma máscara facial solta e monitoramento constante através de um oxímetro de pulso, coloque uma cânula 22 G na artéria central auricular esquerda e outra cânula 22 G na veia auricular da orelha contralateral.
5. Raspe o campo cirúrgico (pescoço) e injete ropivacaína peri-incisional a 0,75% por via intradérmica. Em seguida, raspe a testa e prepare-se para colocar sensores eletroencefalográficos (EEG) pediátricos.
6. Induza anestesia geral com propofol 1-2 mg / kg por via intravenosa (IV) para efeito. Em seguida, intubar imediatamente a traqueia de todos os coelhos com um tubo de silicone (3 milímetros (mm) de diâmetro interno) sob controle capnográfico. Depois, transporte todos os coelhos para a sala de cirurgia, coloque-os em decúbito dorsal e conecte o tubo a um sistema de círculo pediátrico.
7. Alcançar o aprofundamento e a manutenção da anestesia por meio de isoflurano em oxigênio, visando uma concentração máxima de isoflurano expirado de 1,3%.
8. Garanta o monitoramento clínico e instrumental (oximetria de pulso, doppler e pressão arterial invasiva, eletrocardiograma de 3 derivações, EEG, monitoramento da temperatura retal e gases inalados e expirados) até a extubação traqueal.
9. Para manter a hidratação, o lactato de Ringer é fornecido em infusão contínua (IRC) de 5 ml/kg/h por acesso venoso. Sempre confirme a anestesia adequada usando pinças nos dedos dos pés em um intervalo de 10 min.
10. Desinfete o campo cirúrgico usando iodopovidona do manúbrio esterno para ambos os ângulos da mandíbula. Agora, execute o drapeado estéril do campo cirúrgico.
11. Durante a cirurgia, forneça analgesia com lidocaína a um CRI de 50 microgramas (μg)/kg/min e fentanil a 3\u201210 μg/kg/h. Aplique ventilação espontânea ou assistida, bem como hipercapnia permissiva. Realize a gasometria arterial pelo menos uma vez durante a cirurgia.
12. Trate a hipotensão relevante (pressão arterial média < 60 mmHg) com noradrenalina. Evite a hipotermia (temperatura retal ≤ 38 °C) usando uma almofada de aquecimento ou um sistema de aquecimento de ar forçado.

2. Fase cirúrgica – Etapa I

1. Iniciar a cirurgia com uma incisão mediana na pele do manúbrio esternal até o nível dos ângulos da mandíbula/laringe. Disseque nitidamente a pele e os tecidos moles com um bisturi, tesoura cirúrgica e fórceps. Separe a subcutânea e o coxim de gordura medialmente por dissecção romba.
2. Entre na crista superior anterior do músculo esternocleidomastóideo medialmente no lado esquerdo por dissecção romba usando microfórceps e tesoura cirúrgica.
3. Macroscopicamente, execute a preparação romba e separe cuidadosamente a ACC esquerda do nervo vago distalmente para evitar paresia laríngea, usando ainda microfórceps e tesouras cirúrgicas (Figura 1). Observe que a bifurcação da ACC esquerda serve como um marco intraoperatório (Figura 2 e Figura 3A). Para todas as etapas a seguir, use um espalhador de tecido mole para melhorar a visualização cirúrgica.
4. Após a preparação e liberação bem-sucedidas do CCA distal esquerdo do nervo vago, administre papaverina (40 mg / ml, 1: 1 diluído em solução isotônica de cloreto de sódio a 0,9%) localmente. Proteja continuamente todos os segmentos dos vasos com micro swabs seguidos de administração adicional de papaverina externamente. Coloque o CCA esquerdo embebido em papaverina abaixo do tecido muscular autólogo para proteger o vaso da secagem sob a luz do microscópio de operação.
5. Troque de lado enquanto maximiza o conforto do cirurgião durante o procedimento operatório. Repita o mesmo procedimento cirúrgico no lado direito. Dissecar a ACC distal e proximalmente até os pontos de referência predefinidos (bifurcação carotídea ao nível dos ângulos da mandíbula/laringe e veia jugular interna; Figura 3A,B). Reinsira um espalhador e administre micro cotonetes e papaverina conforme descrito anteriormente.
6. Antes da ligadura da ACC proximal direita, injetar heparina (500 unidades internacionais (UI)/kg) sistemicamente através de um cateter venoso auricular.
7. Use um microscópio cirúrgico a partir de agora. Primeiro, ligue a ACC proximal direita com uma sutura não absorvível 4-0 diretamente no final do ponto de referência proximal macroscopicamente visível para evitar qualquer tensão no vaso arterial.
   1. Em segundo lugar, aplique uma ligadura não absorvível 6-0 exatamente 4\u20125 mm distalmente usando um clipe de vaso para medição, considerando que após o corte distalmente da primeira ligadura 4-0, a bolsa arterial resultante terá um comprimento padronizado de cerca de 3\u20124 mm em cada animal (Figura 4A,C).
8. Depois de apertar a ligadura 6-0, aperte o CCA direito o mais distalmente possível com um clipe de vaso temporário (como normalmente usado na cirurgia de aneurisma cerebral) para evitar qualquer dano endotelial e criar um segmento de vaso longo para irrigação, a fim de evitar trombogênese (Figura 4B).
9. Agora faça um corte distalmente à ligadura não absorvível 4-0. Para colher a bolsa arterial (Figura 4C), faça um segundo corte distalmente à ligadura não absorvível 6-0.
10. Limpe a bolsa arterial meticulosamente de todo o tecido mole e meça seu comprimento, largura e profundidade (Figura 4C) com um clipe de vaso. Se nenhuma modificação adicional for necessária, mantenha o enxerto arterial autólogo em uma solução heparinizada (500 UI / 100 ml em cloreto de sódio isotônico a 0,9%) em temperatura ambiente até o uso posterior.

3. Degradação da bolsa arterial

1. Se for necessária uma degradação da bolsa arterial, limpe-a meticulosamente de tecido mole e pré-incube-a com 100 UI de elastase suína dissolvida em 5 ml de tampão Tris à temperatura ambiente no dia do experimento por 20 min. Não use uma técnica de escova. Incube a bolsa arterial intra e extraluminalmente usando um agitador.
2. Antes de colocar a bolsa em uma solução heparinizada de cloreto de sódio isotônico a 0,9%, passe-a suavemente três vezes por 3 min com uma pinça anatômica em solução de cloreto de sódio isotônico a 0,9% para lavar a elastase suína restante.
3. Se necessário, mantenha o lúmen da bolsa arterial aberto com um microtubo de silicone; proteger meticulosamente o CCA esquerdo e direito durante todo o procedimento cirúrgico com micro acolchoamentos úmidos.

4. Fase cirúrgica – Etapa II

1. Para uma preparação adicional do CCA, coloque dois micro cotonetes redondos diretamente abaixo dele para mover a artéria mais superficialmente. Agora, coloque um micro cotonete com acolchoamento roxo sob o CCA esquerdo no terço distal para melhor visualização da artéria.
2. Lave o CCA proximal direito com uma solução de cloreto de sódio isotônico a 0,9% combinado com 500 UI de heparina dissolvida em 100 ml de cloreto de sódio isotônico a 0,9%. Para criar uma anastomose livre de tensão, coloque o CCA direito sob a almofada de gordura/musculatura peritraqueal usando uma tesoura cirúrgica para tunelá-lo para o lado esquerdo. Remova o tecido mole da artéria.
   1. Agora execute uma incisão na boca de peixe de 2 mm no lado proximal do CCA direito usando uma microtesoura e uma pinça.
3. Mude o lado da mesa de operação. Clipe a ACC distal esquerda com outro clipe de vaso temporário seguido pela ACC proximal esquerda com dois clipes de vaso temporários. Proteja todos os segmentos de vasos expostos de secar sob a luz cirúrgica usando microcotonetes úmidos.
4. Libere completamente o terço distal da ACC esquerda dos tecidos moles e realize uma arteriotomia. Use micropinças cirúrgicas e pegue suavemente um pouco de tecido mole. Agora eleve a artéria e faça uma incisão na ACC distal esquerda lentamente com uma microtesoura cirúrgica. Lave os segmentos dos vasos com heparina (500 UI dissolvidas em 100 ml de solução isotônica de cloreto de sódio a 0,9%).
5. Após realizar a arteriotomia com microfórceps curvo e microtesoura, amplie a arteriotomia localizada no terço distal da ACC esquerda distalmente, medindo cerca de 2 vezes o diâmetro do rombudo direito da artéria carótida e do enxerto autólogo. Isso permite fluxo sanguíneo suficiente para a bolsa arterial.
6. Retire a bolsa arterial da solução salina heparinizada. Coloque a bolsa no campo cirúrgico, onde a bifurcação está planejada. Comece a suturar a parte traseira da carótida direita com uma sutura 9-0 não absorvível, seguida de uma sutura na parte traseira cranialmente localizada ao nível da incisão na boca do peixe. Termine de costurar a parte traseira de distal para proximal com pontos únicos.
7. Durante a sutura, mantenha todas as bolsas pré-incubadas de elastase úmidas com irrigação contínua. Ao suturar a parede do vaso da bolsa, use microfórceps cirúrgicos curvos para abrir suavemente o lúmen com sua ponta. Sempre que suturar partes da CCA esquerda ou direita proximal, use micropinças cirúrgicas retas. Em seguida, suture o verso horizontal.
8. Em seguida, suture a parte frontal horizontal, começando na cúpula do aneurisma movendo-se para sua base. Depois, comece com pontos únicos distalmente na parte da frente, movendo-se caudalmente.
   1. Para todas as etapas 4.5 a 4.8, durante a sutura da anastomose, preste atenção apenas para agarrar a parte do vaso próxima à arteriotomia para evitar estenose iatrogênica. Além disso, umedeça continuamente todos os segmentos dos vasos durante todo o procedimento cirúrgico extraluminalmente com uma seringa cheia de solução heparinizada de cloreto de sódio (500 UI dissolvidos em 100 ml de cloreto de sódio isotônico a 0,9%) e proteja-os com microswab úmidos.
   2. Antes de terminar a anastomose, irrigue todo o complexo com uma solução heparinizada de cloreto de sódio isotônico a 0,9% intraluminal (500 UI dissolvidos em 100 ml de cloreto de sódio isotônico a 0,9%). Esteja ciente de que as bolsas arteriais modificadas com elastase devem ser costuradas o mais rápido possível devido à sua forte tendência a ressecar e trombose. Devido ao comportamento agressivo da concentração de elastase residual na bolsa em relação à digestão dos vasos circunferenciais, prossiga rapidamente com a cirurgia para reperfundir o complexo de vasos rapidamente.
9. Remova todos os grampos vasculares temporários gradualmente.
   1. Remova o clamp distal do CCA esquerdo. Aceite um pequeno sangramento e estanque-o imprimindo suavemente microswabs na anastomose. Em seguida, remova a pinça do CCA direito, pressione suavemente com micro cotonete e pinça para evitar a formação de trombos.
   2. Se necessário, substitua os clipes vasculares temporários para fornecer coagulação suficiente. Em seguida, alivie os dois clipes do vaso do lado esquerdo proximalmente. Se necessário em qualquer etapa, substitua os clipes para permitir a coagulação ou para realizar a recostura.
10. Nesta fase, realize a angiografia de fluorescência do complexo de vasos (Figura 5)
    NOTA: A angiografia de fluorescência é realizada administrando 1 ml de fluoresceína IV, usando 2 filtros passa-banda, um smartphone com câmera de vídeo e um holofote de bicicleta. Esse procedimento já foi descrito em outro artigo20,21,22.
11. Por fim, feche a situação operatória. Readapte e suture suavemente a almofada de gordura com uma sutura reabsorvível 3-0 com nódulos únicos para proteger a anastomose. Feche a subcutânea e a pele da mesma maneira.

5. Fase pós-cirúrgica

1. Interromper a administração de isoflurano e analgesia sistêmica ao final da cirurgia e realizar a extubação traqueal assim que o reflexo de deglutição retornar.
2. Administrar 0,5 mg/kg de meloxicam IV, 10 mg/kg de aspirina (ASS) IV, 100 μg de vitamina B12 SC e 20 mg/kg de clamoxila IV.
3. Forneça oxigenação suplementar e aquecimento ativo até que os coelhos tenham recuperado espontaneamente a decúbito esternal.
4. Realizar acompanhamento pós-operatório e cuidados com os animais quatro vezes ao dia durante os primeiros três dias, de acordo com as diretrizes para avaliação e manejo da dor em roedores e coelhos23,24.
5. Administrar analgesia pós-operatória por meio de adesivo de fentanil (12 μg/h) aplicado na orelha externa, meloxicam uma vez ao dia SC por três dias e metadona como terapia de resgate SC, de acordo com a folha de pontuação para avaliação da dor. Administrar 250 UI/kg de heparina de baixo peso molecular (LMH) por via subcutânea durante três dias em todos os coelhos.

Resultados

Figura 1: Etapa inicial da operação.

Etapa operatória inicial, representando a artéria carótida esquerda (seta branca), nervo vago (seta preta) (A) e a separação cuidadosa da artéria carótida esquerda do nervo vago distalmente para evitar paresia laríngea. <...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
3-0 sutura reabsorvível	Ethicon Inc., EUA	VCP428G
4-0 sutura não absorvível	B. Braun, Alemanha	G0762563
6-0 sutura não absorvível	B. Braun, Alemanha	C0766070
9-0 sutura não absorvível	B. Braun, Alemanha	G1111140
Adrenaline	Amino AG	1445419	any generic
Amiodarone	Helvepharm AG	5078567	qualquer genérico
Máquina de anestesia	Dräger		any other
Aspirina	Sanofi-Aventis (Suisse) SA	622693	qualquer genérico
Atropine	Labatec Pharma SA	6577083	qualquer genérico
Filtro passa-banda azul	Thorlabs	FD1B	qualquer outro
Filtro passa-banda verde	Thorlabs	FGV9	qualquer outro
Fórceps			qualquer outro
Bicycle spotlight			any other
Biemer vessel clip (2 x)	B. Braun Medical AG, Aesculap, Suíça	FD560R	temporary
Índice bispectral (neonatal)			qualquer outro
Blood pressure cuff (neonatal)			any other
Clamoxyl	GlaxoSmithKline AG	758808	qualquer generic
Dexmedetomidina	Ever Pharma	136740-1	qualquer genérico
Eletrodos			qualquer outro
Elastase	Sigma Aldrich	45125	any generic
Ephedrine	Amino AG	1435734	qualquer genérico
Esmolol	OrPha Swiss GmbH	3284044	qualquer genérico
Fentanil (uso intravenoso)	Janssen-Cilag AG	98683	qualquer genérico
Fentanil (transdérmico)	Mepha Pharma AG	4008286	qualquer genérico
Fluoresceína	Curatis AG	5030376	qualquer genérico
Fragmin	Pfizer PFE Switzerland GmbH	1906725	qualquer genérico
Glyco			any generic
Almofada			de aquecimentoqualquer outro
Solução isotônica de cloreto de sódio (0,9%)	Fresenius KABI	336769	qualquer genérico
Cetamina	Pfizer	342261	qualquer genérico
Agitador de laboratório	Stuart	SRT6	qualquer outro
Lidocaína	Streuli Pharma AG	747466	any generic
Longuettes			any other
Metacam	Boehringer Ingelheim	P7626406	any generic
Methadone	Streuli Pharma AG	1084546	qualquer genérico
Microtubos			qualquer outro
Micro porta-agulha			qualquer outro
Midazolam	Accord Healthcare AG	7752484	qualquer genérico
Porta-agulha			qualquer outro
O2-Face mask			any other
Microscópio de operação	Wild Heerbrugg		qualquer outro
Papaverine	Bichsel		any generic
Prilocaína-lidocaína creme	Emla		qualquer genérico
Propofol	B. Braun Medical AG, Switzerland		any generic
Oxímetro			qualquer generic
Sonda de temperatura retal (neonatal)			qualquer outro
Ropivacaína	Aspen Pharma Schweiz GmbH	1882249	any generic
Scalpell	Swann-Morton	210	any other
Small animal shaver			any other
Smartphone			any other
Pinça de tecidos moles			qualquer outro
Espalhador de			qualquer outro
Tigelas			qualquer outro
Micro cotonetes			qualquer outro
Estetoscópio			qualquer outro
Micro-fórceps			qualquer outro
Micro-tesouras retas			qualquer outro
Pinças			qualquer outro
Campo cirúrgico			qualquer outro
Tesoura			qualquer outro
Seringas 1 ml, 2ml e 5 ml			qualquer outro
Tris-Buffer	Sigma Aldrich	93302	qualquer generic
Aplicador de clipe vascular	B. Braun, Alemanha	FT495T
Veia e cateter arterial 22 G			qualquer genérico
Vitarubin	Streuli Pharma AG	6847559	qualquer genérico
Yasargil titan standard clip (2 x)	B. Braun Medical AG, Aesculap, Suíça	FT242T	temporário

bipolar de eletrocardiograma de pulso tecidos moles de esponja de aço inoxidável estéreis retas e curvas e curvas retas e curvas cirúrgica