Este vídeo demonstra um ensaio baseado em impedância para medir a invasão e migração de células de glioblastoma. As células degradam a matriz extracelular, movem-se através de membranas microporosas e aderem a eletrodos, gerando impedância. Esta análise em tempo real reflete seu potencial invasivo para aplicações de pesquisa do câncer.
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Artigo de método
Medições baseadas em impedância de invasão de células cancerígenas cerebrais
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28 de abril de 2025
Neste artigo
Resumo
Protocolo
1. Preparação do Sistema de Análise Celular em Tempo Real, Placas de Invasão e Migração Celular (CIM) e Células U-118MG Eletroporadas para Galvanização
- Coloque o sistema de análise celular em tempo real em uma incubadora CO2} em condições de cultura 5–6 h antes de início do experimento para estabilizar o sistema às condições de cultivo.
- Para o ensaio de invasão, placa de 50 μL de DMEM (meio simples) contendo gel de matriz extracelular (MEC) a 0,1 μg/μL em cada poço da câmara superior da placa CIM. Para evitar bolhas de ar, use o método de pipetagem reversa. Remova imediatamente 30 μL de gel ECM, deixando 20 μL no poço.
- Após o revestimento em gel ECM, manter a placa na incubadora em condições de cultura durante 4 h com a tampa colocada. Durante o revestimento e secagem do gel ECM, tome medidas preventivas para evitar o contato direto com os eletrodos da câmara superior das placas com as mãos, as superfícies do gabinete de biossegurança ou a incubadora de CO2.
- Para configurar o programa de medição de impedância, clique duas vezes no ícone de software associado (consulte Tabela de materiais) para abrir o aplicativo de software do sistema (unidade de controle). Cada berço tem uma janela individual com diferentes guias para definir as condições experimentais, o intervalo de tempo e a duração da medição da impedância e a análise de dados.
- Na guia Layout, defina poços quádruplos para cada condição biológica e defina medições de impedância celular em duas etapas na guia Schedule. O primeiro passo é para uma medição de linha de base única (uma varredura com um intervalo de 1 minuto) e o segundo passo é medir a impedância da célula nos respectivos berços individuais para um experimento real. Para migração, use 145 varreduras com intervalo de 10 min e, para invasão, 577 varreduras com intervalo de 10 min, definido individualmente) nos respectivos berços individuais.
- Uma hora antes do início da medição da impedância celular, adicione 160 μL de DMEM com 10% de FBS como quimioatraente aos poços da câmara inferior da placa. Monte a câmara superior contendo os poços revestidos com gel ECM ou os poços não revestidos com a câmara inferior para medir a invasão e a migração, respectivamente.
- Encha os alvéolos da câmara superior com 50 μL de meio sérico baixo e coloque-os no berço do sistema. Verifique se todos os poços são reconhecidos pela unidade de controle clicando na guia Message. Se a mensagem for apresentada como OK, a placa no berço está pronta para a experiência.
- Pré-incubar as placas completamente cheias na incubadora em condições de cultura durante 1 h antes das medições no berço do sistema de análise celular em tempo real, que é essencial para a aclimatação de uma placa embalada às condições de cultura celular.
- Para a colheita de células tratadas com meio de baixo soro, lave as células que crescem em placas de cultura com 1x PBS e adicione 2 mL de tripsina-EDTA a 0,05% (ácido etilenodiaminotetracético). Colocar na incubadora durante 30 s e retirar a tripsina-EDTA. Colete células no meio de soro baixo teor sérico em um tubo de 15 mL e conte as células usando um contador de células automatizado portátil.
- Após a contagem, centrifugue as células a 100 x g por 5 min e descarte o sobrenadante.
- Ressuspenda 800.000 células em 800 μL de meio sérico baixo para os ensaios de migração e invasão. Além disso, ressuspenda 300.000 células em 2 mL de meio de cultura e semeie em um prato de 35 mm para análise de Western blot para confirmar o knockdown regulado de Crk e CrkL.
2. Leitura de linha de base, semeadura das células, e Medição e Visualização de Impedância Celular
- Meça a leitura da linha de base clicando no botão berço Iniciar. A linha de base deve ser lida após a pré-incubação das placas por 1 h no berço do sistema de análise celular em tempo real em condições de cultura na incubadora de dióxido de carbono e antes da semeadura das células nos respectivos poços na câmara superior.
NOTA: Assim que o botão berço Iniciar for clicado, a unidade de controle perguntará se deseja salvar o experimento file. Depois que o arquivo é salvo, o analisador de base mede a impedância da célula de linha de base conforme definido no programa inicialmente e entra em um modo de pausa até que o botão base Start seja clicado novamente para medir a impedância da célula na segunda etapa. - Retire ambas as placas para migração e invasão dos berços após a medição da linha de base e mantenha-as no gabinete de biossegurança.
- Semear 100 μL de células (100.000 células) em quadruplicados para cada condição biológica na câmara superior da placa CIM nos respectivos poços, conforme programado na unidade de controle do berço por pipetagem reversa para evitar bolhas de ar.
- Após a semeadura, mantenha a placa sob um gabinete de biossegurança por 30 minutos em temperatura ambiente para permitir que as células se assentem uniformemente no fundo. Transfira a placa de volta para o respectivo berço e clique no botão de partida do berço para começar a medir a impedância da célula conforme programado na segunda etapa de 1.5.
- Após a última varredura, o experimento é concluído e os resultados são salvos automaticamente.
- Na guia Análise de dados, visualize as alterações na impedância da célula como índice de célula de maneira dependente do tempo durante ou após a conclusão do experimento. Cada uma das respectivas condições de quadruplicados pode ser visualizada individualmente ou como médias e/ou desvios padrão clicando nas caixas Opções para média e desvio padrão.
- Para exportar dados de índice de célula para um arquivo de planilha, abra um arquivo de planilha vazio, coloque o cursor no meio da janela Análise de dados e clique com o botão direito do mouse. Na caixa de diálogo exibida, escolha a opção Copiar dados para o formato de lista e cole os dados na planilha aberta.
- Ajuste o tempo nos dados brutos para representar a hora de início real da medição de impedância da célula. A hora de início da segunda etapa é definida como zero.
NOTA: A unidade de controle tem a opção de obter o índice da célula com ou sem normalização (ou seja, índice de célula normalizado) e visualizar os resultados como uma apresentação gráfica de maneira dependente do tempo. Neste exemplo, os dados do índice de célula são exportados sem normalização para processamento e apresentação gráfica. - Libere o experimento clicando no botão Liberar em cada base.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1300 Series Class II, Type A2 | |
| CIM plates | Divisão de Análise de Células da Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Placas |
| Meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) | ATCC | 302002 | Meio de cultura usado para célula cultura |
| solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) | |||
| Incubadora de dióxido de carbono Heracell VIOS 160i | ThermoFisher Scientific | 51030285 | Incubadora |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | Gel |
| RTCA software | Divisão de Análise Celular da Agilent Technologies, Inc | Instrumento usado para experimento | |
| Scepter | Millipore | C85360 | Contador |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| U-118MG | ATCC | ATCC HTB15 | Linhas celulares usadas para experimentos |
| xCELLigence RTCA DP | Divisão de Análise de Células da Agilent Technologies, Inc | 380601050 |
