Desenvolvendo um modelo de pressão translaminar usando um sistema autônomo translaminar

Abstract

Fonte: Sharma, T. P., et al., Modelo de Sistema Autônomo Translaminar para a Modulação da Pressão Intraocular e Intracraniana em Segmentos Posteriores de Doadores Humanos. J. Vis. Exp. (2020).

Este vídeo demonstra o procedimento de preparação de um olho humano para estudar os efeitos da pressão translaminar na sinalização das células ganglionares da retina, simulando as pressões intraoculares e intracranianas em um sistema autônomo translaminar.

Protocol

Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Preparação e esterilização de equipamentos e suprimentos

1. Consulte a Tabela de Materiais para obter uma lista completa de suprimentos necessários, bem como números de fornecedores e catálogos.
2. Antes de usar, esterilize todos os equipamentos e instrumentos autoclavando ou usando ampolas de óxido de etileno.

2. Preparação do meio

1. de perfusãoAdicione 1% de penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL de penicilina, 10.000 μg/mL de estreptomicina em 0,85% de NaCl) e 1% de L-glutamina (200 mM) a 1.000 mL de meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) com alto teor de glicose.
2. Esterilize o meio de perfusão passando por um filtro de 0,22 μm.

3. Configuração

1. do sistema autônomo translaminar (TAS)Configure seringas de entrada (reservatórios de pressão intraocular (PIO) e pressão intracraniana (PIC)).
   1. Adicione 30 mL do meio de perfusão (seção 2) a uma seringa de 30 mL. Encaixe uma torneira de 3 vias na seringa de 30 mL. Conecte um filtro hidrofílico de 0.22 μm à torneira de 3 vias. Conecte um adaptador de ponta Luer de 15 G ao filtro hidrofílico de 0.22 μm.
   2. Remova as bolhas de ar da configuração da seringa. Conecte a tubulação ao adaptador de stub Luer de 15 G. Feche a porta lateral da torneira com uma tampa de trava universal não ventilada. Repita para um total de duas configurações.
   3. Rotule uma seringa como pressão intracraniana do canal 1 (CH1 ICP) e a outra seringa como pressão intraocular do canal 2 (CH2 IOP).
2. Configure as seringas de saída (reservatórios IOP e ICP).
   1. Anexe uma torneira de 3 vias a uma seringa de 30 mL. Conecte um adaptador de ponta Luer de 15 G à torneira de 3 vias. Conecte a tubulação ao adaptador de stub Luer de 15 G.
   2. Feche a porta lateral da torneira com uma tampa de trava universal não ventilada. Repita para um total de duas configurações. Rotule uma seringa como CH1 ICP e a outra seringa como CH2 IOP.

4. Preparação do globo ocular inteiro humano

NOTA: Se forem recebidos olhos inteiros, siga o procedimento abaixo para separar o segmento anterior do segmento posterior do olho. Se os olhos forem recebidos divididos, comece na etapa 4.4.

1. Coloque um olho inteiro na solução de iodopovidona por 2 min.
2. Enxágue o olho em uma solução estéril tamponada com fosfato (PBS) para remover a iodopovidona. Repita duas vezes.
3. Remova os anexos de todo o globo ocular usando uma pinça e uma tesoura. Dividir o olho no equador para separar os segmentos anterior e posterior do olho.
4. Remova a bainha do nervo óptico. Remova o humor vítreo do segmento posterior.
5. Apare a esclera adicional do segmento posterior, se necessário, para garantir um bom ajuste na cúpula redonda da câmara IOP (inferior). Usando uma pinça, certifique-se de que a retina esteja espalhada uniformemente sobre a parte posterior do segmento.
6. IOP (bottom) chamber setup
   1. Coloque o segmento posterior humano na câmara IOP (inferior) do TAS sobre a cúpula redonda com o nervo óptico voltado para cima.
   2. Sele o segmento posterior usando o O-ring de resina epóxi com quatro parafusos, garantindo uma vedação firme.
   3. Insira a tubulação nas portas IN e OUT da câmara IOP (inferior). A seringa de entrada de PIO com tubo contendo meio é inserida na porta IN e a seringa de saída de PIO vazia com tubo é inserida na porta OUT.
   4. Use o método push/pull para infundir lentamente o meio de perfusão na porta de entrada para encher a ocular posterior e, ao mesmo tempo, puxar lentamente o meio de perfusão através da seringa de saída para remover quaisquer bolhas de ar das linhas. Pare de infundir o meio quando os tubos IN e OUT estiverem livres de bolhas de ar.
   5. Trave as torneiras na posição desligada. Remova a seringa de 30 mL do conjunto do filtro da porta IOP IN e reabasteça-a com 30 mL de meio. Em seguida, substitua a seringa pelo conjunto do filtro.
7. ICP (top) chamber setup
   1. Coloque a câmara/tampa ICP (superior) sobre a parte de trás do segmento posterior. Certifique-se de que o nervo óptico esteja dentro da câmara superior. Sele a câmara superior com quatro parafusos.
   2. Insira a tubulação nas portas IN e OUT da câmara ICP (superior). A seringa de entrada ICP com tubo contendo meio é inserida na porta IN e a seringa de saída ICP vazia com tubo é inserida na porta OUT.
   3. Suave e lentamente infundir o meio na porta IN para encher a câmara ICP e remover as bolhas de ar das linhas usando o método push/pull. Pare de infundir o meio quando a câmara ICP e a tubulação IN e OUT estiverem livres de bolhas de ar.
   4. Trave as torneiras na posição desligada. Remova a seringa de 30 mL do conjunto do filtro ICP na porta e reabasteça-a com 30 mL de meio. Em seguida, substitua a seringa pelo conjunto do filtro.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
#122, 1-1/8" Inside x 1-5/16" Outside Diam, Viton O-Ring, 3/32" Thick, 755 Durometer 50 Pack	Amazon	B07DRGPPZJ
114 Buna-N O-Ring, 70A Durometer, Preto, 5/8" ID, 13/16" OD, 3/32" Largura (Pacote de 100)	Amazon	B000FMYRHK
30 mL Seringas sem Agulha	Vitality Medical	302832
Torneira de 3 vias, 2 travas Luer fêmeas, trava Luer macho giratória, tampa ventilada	QOSINA	2C6201
4-40 X 1/2 PH PAN MS SS/CHROME & chave de fenda Phillips de tamanho apropriado	Brikksen Stainless Steel Fastners	PPMSSSCH4C.5
ANPROLENE 16 LARGE AMPULE	Fisher Scientific	NC9085343
Betadine	Purdue	PUR1815001EACH
Corning 100 x 20mm tratados com cultura de tecidos culture dishes	Sigma-Aldrich	CLS430167-100EA
Corning L-glutamine Solution	Fisher Scientific	MT25005CI
Covidien 3033 Curity Gauze Sponge, 4" x 4", 12-Ply, Estéril, 1200/CS	Med Plus Medical Supply	COV-3033-CS
Dressing Forceps Delicate Curved (serrilhado)	Katena	K5-4010
Dumont #5 - Fine Forceps	F.S.T.	td style='width:td style='width:td style='td style='width:td style='width:[em inglês] 174pt;'>11254-20
Eye Scissors Standard Curved	Katena	K4-7410
Falcon 150 x 15mm Plain Sterile Disposable Petri Plates	Capitol Scientific	351058
Fisherbrand 4 oz. Specimen Containers	Fisher Scientific	16-320-730
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches	Fisher Scientific	01-812-54
Bolsas de esterilização de vedação instantânea Fisherbrand	Fisher Scientific	01-812-55
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Poutches	Fisher Scientific	01-812-58
HyClone Águias Modificadas de Dulbecco Medium	Fisher Scientific	SH3024302
HyClone Penicillin Streptomycin 100X Solution	Fisher Scientific	SV30010
Filtro hidrofílico com entrada Luer Lock fêmea, saída deslizante Luer macho, azul e transparente	Qosina	28217
Transdutores de pressão hidrostática, DELTRAN ® II, Catálogo # DPT-200 com vazão 3CC/HR	AD instruments	DPT-200
JG15-0.5HPX 15 Gauge 0.5" NT Premium Series Dispensing Tip 50/Box	Jenson Global	JG15-0.5HPX 15
Keyence B2‐X710 microscope	Keyence	B2-X710
LabChart 8	AD instruments	LabChart 8
Leica ST5020 Multi-stainer	Leica	ST5020
Non-Vented Universal Luer Lock Cap, Branco	QOSINA	65811
Octal Bridge Amp (Model # FE228)	AD instruments	FE228
Pharmco Products ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF	Fisher Scientific	NC1675398
Phosphate Buffered Solution (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
PowerLab 8/35 (Model # PL3508)	AD instruments	PL3508
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI	ThermoFisher	P36935
Push-to-Connect Tube Fitting for Air and Water Straight Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 NPT Male	McMAster-Carr	7880T113
Push-to-Connect Tube Fitting with Universal Thread for Air and Water, Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 Pipe	McMAster-Carr	51235K101
Saint-Gobain Tygon S3 E-3603 Flexible Tubing 500 ft.	Fisher Scientific	14-171-268
Superblock T20	Fisher Scientific	PI37536
Surgical Scissors - Sharp-Blunt	F.S.T.	14001-14
Tissue Forceps Delicate 1x2 Teeth Curved	Katena	K5-4110
Sistema Autônomo Translaminar (TAS)	Centro de Ciências da Saúde da Universidade do Norte do Texas	N/A
USA Size 030 O-ring Buna-N, B1000, 70 Durometer, Black, Buna-N (NBR, Nitrile, Buna)	Marco Rubber & Plastics	B1000-030