Ensaio de fagocitose de células vivas de células semelhantes à microglia usando sinaptossomos humanos

Resumo

Fonte: Funes, S., et. al., Células semelhantes à microglia humana: diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas e ensaio de fagocitose de células vivas in vitro usando sinaptossomos humanos. J. Vis. Exp. (2022)

Este vídeo demonstra um ensaio para estudar a capacidade fagocítica de células semelhantes à microglia usando sinaptossomos marcados com corante fluorescente sensível ao pH.

Protocolo

1. Live-cell phagocytosis assay
   1. Plate 20-30 × 10⁴ PMPs em placas de 96 poços em 100 μL de meio completo de iMG e siga o processo de diferenciação por 10 dias.
   2. No dia do ensaio, prepare a solução de coloração nuclear adicionando 1 gota de uma coloração nuclear para células vivas em 2 mL de meio basal iMG.
   3. Remova 40 μL de meio por alvéolo da placa de 96 poços e adicione 10 μL da solução de coloração nuclear usando uma pipeta multicanal. Incubar a placa a 37 °C e 5% de CO₂ durante 2 h.
   4. Descongele os sinaptossomos rotulados no gelo e sonique suavemente usando um sonicador de água por 1 min. Transfira imediatamente os sinaptossomos de volta para o gelo. Diluir os sinaptossomos marcados em meio completo de MGI na proporção de 1 μL de sinaptossomos por 50 μL do meio.
      NOTA: A concentração de sinaptossomo depende do ensaio e pode exigir otimização. Para manter uma porcentagem relativamente baixa (ou seja, 0,1% ou menos) de DMSO no meio, é aconselhável não adicionar mais de 2 μL de sinaptossomos por poço.
   5. Como controle negativo, pré-trate alguns poços com citocalasina D para inibir a polimerização da actina e, portanto, a fagocitose. Preparar uma solução de citocalasina D 60 μM em meio completo de MGIi. Adicionar 10 μl desta solução a cada poço para obter uma concentração final de 10 μM e incubar a 37 °C e 5% de CO₂ durante 30 min.
   6. Retire a placa da incubadora e incube a 10 °C durante 10 min. Mantenha a placa no gelo e adicione 50 μL de meio contendo sinaptossomas.
   7. Centrifugar a placa a 270 × g durante 3 min a 10 °C e manter a placa congelada até à aquisição da imagem.
2. Aquisição e análise de imagens
   1. Insira a placa em um leitor de imagens de células vivas e selecione os poços a serem analisados.
   2. Selecione uma lente objetiva de 20x.
   3. Ajuste o foco, a intensidade do diodo emissor de luz (LED), o tempo de integração e o ganho dos canais de campo claro e azul (4',6-diamidino-2-fenilindol [DAPI]). A fluorescência do sinaptossomo deve ser insignificante no momento inicial. Use o canal de campo claro como referência para focar no canal vermelho (RFP). O tempo e o ganho de integração podem variar entre os experimentos; use estas configurações iniciais para o canal vermelho: LED: 4, tempo de integração: 250 e ganho: 5.
   4. Selecione o número de blocos individuais a serem adquiridos em uma montagem por poço (por exemplo, adquira 16 blocos no centro do poço, gerando imagens de aproximadamente 5% da área total do poço). Defina a temperatura para 37 °C e o intervalo de tempo desejado para a geração de imagens.
      NOTA: As imagens foram adquiridas a cada 1 - 2 h por até 16 h neste estudo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cell culture materials
Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate	Corning	353872
CellAdhere Laminin-521	STEMCELL Tecnologia	77004	Referido como laminação 521
Componentes da mídia base iMG
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634010	Final concentration 1x
GlutaMAX	Gibco	35050061	Concentração final 1x
N2 suplemento, 100x	Gibco	17502-048	Concentração final 1x
Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL)	Gibco	15140122	Concentração final 100 U/mL
Componentes do iMG complete media
55 mM 2-mercaptoethanol	Gibco	21985023	Concentração final 55 μM
IL-34	PeproTech ou Biologend	200-34 ou 577904	Concentração final 100 ng/mL
iMG base media			Concentração final 1x
M-CSF	PeproTech	300-25	Concentração final 5 ng/mL
TGF-β	PeproTech	100-21	Concentração final 50 ng/mL
Phagocytosis assay dyes
NucBlue Live Ready reagent	Invitrogen	R37605
pHrodo Red, éster succinimidílico	ThermoFisher Scientific	P36600	Referido como corante
Outros reagentes de cultura de células
Citocalasina D	Sigma		Concentração final 10 μM
Software e Equipamentos
Centrifuge	Eppendorf	Model 5810R
Cytation 5 leitor de imagens de células vivas	Biotek
Gen5 Microplate Reader and Imager Software	Biotek	versão 3.03

sensível ao pH