Detecção de Cotransportador 2 de Cloreto de Potássio Neuronal Fosforilado via Western Blotting

Resumo

Fonte: Josiah, S. S., et al. Estudo das funções e atividades do co-transportador neuronal K-Cl KCC2 usando Western Blotting. J. Vis. Exp. (2022).

O vídeo demonstra as etapas para detectar e quantificar a proteína cotransportador 2 de cloreto de potássio fosforilada (KCC2) em um lisado celular. Este processo envolve imunoprecipitação para isolar KCC2 fosforilada e quimioluminescência para quantificar a proteína isolada.

Protocolo

1. Cultura celular e transfecção

1. Aqueça todos os reagentes no banho de esferas (37 °C) antes do procedimento de cultura celular. Prepare o meio de cultura, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), suplementado com 10% de soro fetal bovino, 1% de L-glutamina 2mM, 100x aminoácido não essencial, 100 mM de piruvato de sódio e 100 unidades / mL de penicilina-estreptomicina.
2. Descongele de forma estável o rim embrionário humano de rato KCC2b 293 células (HEK293^rnKCC2b) completamente no banho de esferas (37 °C). Transfira as células do tubo criogênico para um tubo de centrífuga contendo 5 mL de meio fresco. Gire a célula a 1200 ×g por 3-5 min.
3. Use uma pipeta de aspiração (fixada a uma bomba de vácuo) para aspirar o sobrenadante e adicione 10 mL de meio fresco para ressuspender as células. Transfira a suspensão celular para uma placa de prato de 10 cm.
4. Coloque o prato na incubadora e deixe-o crescer por 48 h a 37 °С em uma atmosfera umidificada de 5% de CO₂. Monitore o período de incubação para garantir o crescimento celular saudável. Divida ainda mais as células quando atingirem mais de 90% de confluência após o período de incubação.
5. Aspire a mídia antiga do prato de células e enxágue suavemente as células com 2 mL de solução salina tampão fosfato (PBS). Adicione 2 mL de tripsina e incube por cerca de 1-2 min em temperatura ambiente.
6. Use 2 mL de meio completo para lavar suavemente as células tripsinizadas no prato. Adicione 9 mL de mídia fresca a novos pratos e adicione 1 mL de solução do prato antigo a cada um dos novos. Transfira as placas de células divididas de volta para a incubadora por 48 h para atingir ≥ 90% de confluência.
7. Trate as células com dimetilsulfóxido (DMSO) como controle, 8 μM de estaurosporina ou 0,5 mM de N-etilmaleimida (NEM) por 15 min antes de colher as células em tampão de lise.

2. Preparação de lisados celulares e carregamento de amostras

1. Aspirar o meio na placa de cultura (a partir de procedimentos de transfecção). Coloque a cultura de células no gelo e lave as células com PBS gelado.
2. Aspire o PBS e, em seguida, adicione 1,0 mL de tampão de lise gelada contendo 50 mM de tris-HCl (pH 7,5), 1 mM de etilenoglicol-bis(β-éter aminoetílico)-N,N,N',N',N'-ácido tetracético (EGTA), 1 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 50 mM de fluoreto de sódio, 5 mM de pirofosfato de sódio, 10 mM de sódio-β-glicerofosfato, 1 mM de ortovanadato de sódio, 1% (p/v) Triton X-100, 0,27 M de sacarose, 1 mM de benzamina, 0,1% (v/v) de 2-mercaptoetanol e 2 mM de fenilmetilsulfonilfluoreto (PMSF) para o prato.
   NOTA: O volume do tampão de lise durante a colheita das células varia de acordo com o tamanho do prato, por exemplo, 1 mL de tampão de lise é adequado por 1 x 10⁷ células/prato de 100 mm/frasco^de 150 cm 2, enquanto 0,5 mL é adequado por frasco de 5 x 10⁶ células/prato de 60 mm/frasco de 75 cm².
3. Use um raspador de células de plástico frio para raspar as células do fundo do prato e, em seguida, use suavemente uma pipeta para transferir a suspensão da célula para um tubo de microcentrífuga já no gelo. Agite constantemente o tubo por 30 min a 4 °C.
4. Gire os lisados celulares em uma centrífuga fria (4 °C) a 16.000 x g por 20 min, remova o tubo suavemente da centrífuga e coloque-o no gelo. Recolher o sobrenadante num tubo fresco pré-arrefecido e rejeitar o pellet.
   NOTA: Pode ser necessário variar a força e o tempo de centrifugação dependendo do tipo de célula. No entanto, as diretrizes gerais incentivam a centrifugação a 16.000 x g por 20 min. No entanto, isso deve ser determinado para cada experimento. Por exemplo, células delicadas como leucócitos precisam de uma velocidade de centrifugação muito leve.

3. Preparação de imunoprecipitantes a partir de lisados celulares

1. Pipete 300 μL de proteína-G-sepharose em um tubo de microcentrífuga. Gire a solução a 500 x g por 2 min e descarte o sobrenadante.
2. Adicione 500 μL de PBS e vortex a solução bem. Gire a solução a 500 x g por 2 min e descarte o sobrenadante. Repita esta etapa.
3. Misture 1 mg de anticorpos anti-KCC2 Thr906 e anti-KCC2 Thr1007 com 200 μL de grânulos de proteína G-sepharose e complete o volume para 500 μL com PBS. Agite em uma plataforma vibratória ou roda giratória por 2 h a 4 ° C. Lave 2x com PBS.
4. Realize a quantificação de proteínas em todos os lisados celulares e adicione 1 mg do lisado celular aos grânulos lavados. Incubar suavemente em um rotador de ponta a ponta por 2 h a 4 °C. Girar os grânulos e lavá-los 3x com PBS contendo 150 mM de cloreto de sódio (NaCl).
5. Lave os imunoprecipitantes (esferas) 3x com 200 μL de PBS. Ressuspenda o pellet final em 100 μL de 1x tampão de amostra de dodecil sulfato de lítio (LDS).
6. Agite os tubos em um agitador de rotor à temperatura ambiente por 5 min e incube-os em um bloco de aquecimento a 75 °C por 10 min. Centrifugue a amostra de carregamento a 11.000 x g por 2 min e use o sobrenadante para carregamento de gel.

4. Executando o western blot

1. Monte o aparelho de fundição e despeje o gel separador a 8% recém-preparado (consulte a Tabela 1 para receita/preparação) para moldar o gel, deixando cerca de 2 cm de espaço a partir da parte superior do vidro de fundição. Adicione 200 μL de isopropanol absoluto à configuração e deixe-a repousar em temperatura ambiente por 60 min.
   NOTA: A receita de gel de poliacrilamida para eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE) depende do tamanho da proteína de interesse (Tabela 2). Portanto, anote o tamanho da proteína antes de determinar a porcentagem de gel desejada.
2. Use uma pipeta para remover o isopropanol e enxágue cuidadosamente o gel com cerca de 200 μL de água destilada. Adicione gel de empilhamento a 6% recém-preparado (consulte a Tabela 1 para receita/preparação) para preencher o espaço de aproximadamente 2 cm na configuração de fundição. Coloque suavemente no pente de poço e deixe repousar em temperatura ambiente por 30 min.
3. Fixe o gel fundido no tanque de eletroforese.
4. Dissolva 30,3 g de base Tris, 144,1 g de glicina e 10 g de SDS em 1000 mL de água destilada para preparar 10x tampão de transferência. Prepare 1x tampão de corrida adicionando 10 mL de 10% de SDS e 100 mL de 10x tampão de transferência para 890 mL de água destilada.
5. Despeje 1x buffer em execução no tanque. Carregue 5 μL de marcador de peso molecular no primeiro poço e uma quantidade igual de proteína em cada poço do gel SDS-PAGE (entre 18-30 μL, dependendo do tamanho do favo usado). Encha os poços vazios com 1x LDS e deixe o gel funcionar por cerca de 90-120 min a 120 V.
6. Dissolva 58,2 g de base Tris e 29,3 g de glicina em 1000 mL de água destilada para preparar 10x tampão de transferência. Ative a membrana de nitrocelulose com 1x tampão de transferência contendo 20% de metanol. Enxágue o gel e a membrana com o tampão de transferência e espalhe-os suavemente na pilha de preparação.
   NOTA: Não há necessidade de ajustar o pH dos tampões de corrida e transferência, pois eles devem estar no pH ideal necessário. Além disso, é aconselhável preparar esses tampões e armazená-los em temperatura ambiente antes do experimento para economizar tempo.
7. Organize o sanduíche a ser transferido nesta ordem: eletrodo negativo (moldura/extremidade preta) - espuma sanduíche - papel de filtro - gel SDS-PAGE enxaguado - membrana de nitrocelulose enxaguada - papel de filtro - espuma sanduíche - eletrodo positivo (moldura vermelha). Empilhe o sanduíche montado no tanque de transferência e deixe funcionar a 90 V por 90 min ou 30 V por 360 min.

5. Coloração de anticorpos e desenvolvimento de imagem

1. Remova a membrana e deixe secar. Bloqueie a membrana por 1 h em temperatura ambiente usando um tampão de bloqueio feito de 5% de leite desnatado em solução salina tamponada com Tris contendo 0,1% 1x Tween 20 (1x TBS-T).
2. Incube as membranas com diluições apropriadas de anticorpo primário^8,15,19 e beta-actina (controle de carga) em tampão de bloqueio por 1 h em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C. Lave a membrana em três lavagens de 1x TBS-T por 5 min cada.
   NOTA: A incubação da membrana separada com controles de carga, como anticorpos beta-actina, alfa-tubulina ou gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase é para normalizar os outros resultados de western blotting durante a quantificação subsequente. A diluição recomendada para cada anticorpo primário está disponível no manual do fabricante.
3. Incube a membrana lavada com anticorpo secundário diluído 5000 vezes em tampão de bloqueio por 60 min à temperatura ambiente. Novamente, lave a membrana 3x em 1x TBS-T por 5 min cada.
   NOTA: É altamente recomendável que o anticorpo secundário seja criado contra a espécie na qual o anticorpo primário é criado. Por exemplo, se o anticorpo primário do KCC2 total for anti-KCC2 de camundongo, o anticorpo secundário para anti-camundongo deve ser usado.
4. Coloque a membrana lavada na placa de imagem. Misture volumes iguais de cada reagente de quimioluminescência aprimorada (ECL) e espalhe suavemente a solução misturada na membrana para desenvolver sinais.

6. Aquisição de imagens usando um sistema de imagens e quantificação de dados

1. Transfira a placa de imagem para o compartimento apropriado no sistema de imagem para geração de imagens. Abra o software de imagem no computador para processamento de imagem.
2. Na barra de ferramentas, clique em Novo Protocolo e escolha Canal Único. Clique em Selecionar na caixa de diálogo de imagem/aplicação de gel, role até Blot e selecione Chemi Hi Sensitivity ou Chemi Hi Resolution. Em seguida, clique em Configuração de acumulação de sinal para definir a duração e o número de imagens a serem adquiridas.
3. Clique em Posicionar Gel na configuração do protocolo e ajuste o gel no sistema de imagem, se necessário. Clique em Executar Protocolo para adquirir as imagens.
4. Clique com o botão direito do mouse em uma das imagens adquiridas na caixa do catálogo de imagens para salvar as imagens no computador. Navegue até a imagem desejada e clique em Selecionar imagem e continuar na caixa de diálogo de execução.
5. Clique no ícone Image Transform para ajustar o contraste e a saturação de pixels da imagem. Clique no ícone Captura de tela na barra de ferramentas geral para salvar a imagem no computador, dependendo do formato de imagem desejado.
6. Meça as densidades de banda usando o software ImageJ e analise usando ferramentas estatísticas apropriadas.

Resultados

Tabela 1: Receita para fazer mistura de gel de poliacrilamida (separação e empilhamento de soluções de gel).

8 mL de 8% de gel separ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
40% acrylamide	Sigma-Aldrich	A2917	Usado para fazer gel de separação e empilhamento para SDS-PAGE
Amônio por sulfato	Sigma-Aldrich	248614	Usado para fazer gel de separação e empilhamento para SDS-PAGE
anti pSPAK	Dundee University	S670B	Usado como anticorpo primário para western blotting
estilo anti-KCC2	S700C	Usado como anticorpo primário para western blotting
anti-KCC2 pSer940	Thermo Fisher Scientific	PA5-95678	Usado como anticorpo primário para western blotting
anti-KCC2 pThr1007	Dundee University	S961C	Usado como anticorpo primário para western blotting
anti-KCC2 pThr906	Dundee University	S959C	Usado como anticorpo primário para western blotting
anti-mouse	Tecnologia de sinalização celular	66002	Usado como anticorpo secundário para western blotting
anti-NKCC1	Dundee University	S841B	Usado como anticorpo primário para western blotting
anti-NKCC1 pThr203/207/212	Dundee University	S763B	Usado como anticorpo primário para western blotting
anti-rabbit	Cell Signalling technology	C29F4	Usado como anticorpo secundário para western blotting
anti-sheep	abcam	ab6900	Usado como anticorpo secundário para western blotting
anti-SPAK	Dundee University	S669D	Usado como anticorpo primário para western blotting
anti-β-Tubulin III	Sigma-Aldrich	T8578	Usado como anticorpo primário para western blotting
Benzamine	Merck UK	135828	Usado como componente do tampão
Beta-mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M3148	Usado como componente do buffer de carregamento e buffer
Bradford Coomasie	Thermo Scientific	1856209	Usado para quantificação
Aparelho de fundição	Atto	WSE-1165W	Usado para executar eletroforese
Centrifuge	Eppendorf	5804	Usado na preparação
Centrifuge	VWR	MicroStar 17R	Used para amostras de fiação
dimetil sulfóxido (DMSO)
N / A
Meio de águia modificado de Dulbecco - alta glicose	D6429	Usado para cultura de
ECL reagent	Perkin Elmer	ORTT755/2655	Usado para revelar imagem para western blotting
EDTA	Fisher Scientific	D/0700/53	Usado como componente do tampão
EGTA	Sigma-Aldrich	e4378	Usado como componente do tampão
Fonte de alimentação de eletroforese	BioRad	PowerPAC HC	Para fornecer energia para executar eletroforese
Ethanol	ThermoFisher	E/0650DF/17	Used preparing sterilized equipments
Fetal Bovine Serum - calor inativado	Merck Life Sciences UK	F9665	Usado para cultura de
Fumehood	Walker	A7277	Used for cell culture
Gel Blotting - Whatman	GE Healthcare	10426981	Usado em western blotting para fazer sanduíche
Glycine	Sigma-Aldrich	15527	Usado para fazer buffers
GraphPad Prism Software	GraphPad Software, Inc., EUA	Versão 6.0	Usado para plotar gráficos e analisar dados para western blotting
HCl	Acros Organics	10647282	Usado para fazer gel de separação e empilhamento para SDS-PAGE
Bloco de aquecimento	Grant	QBT1	Usado para aquecer amostras
HEK293 cells	Merck UK	12022001-1VL	Cell line for culture experiment<
Wayne Rasband and Contributors; NIH, EUA	ImageJ 1.53e	Usado para medir intensidades de banda de imagens
Imaging system	BioRad	ChemiDoc MP	Usado para tirar imagens
Incubator	LEEC	Precisão LEEC 190D	Usado para cultura
Isopropanol	Honeywell	24137	Used in casting gel for electrophoresis
L-glutamine solution	Sigma-Aldrich	G7513	Usado para cultura
Lithium dodecyl sulfate (LDS)<	NP0008	Usado como buffer de carregamento para western blotting
MEM Aminoácido não essencial	Merck Life Sciences UK	M7145	Usado para célula culture
Microcentrifuge	Eppendorf	5418	Usado para preparar lisados para WB
Leitor de microplacas	BioRad	iMark	Usado para leitura da concentração de proteína do lisado
Microsoft Powerpoint	Microsoft, USA	PowerPoint2016	Usado para editar imagens
Molecular Weight Marker	BioRad	1610373	Usado para western blotting
N-etilmaleimida	Thermo Fisher Scientific	23030	Usado para experimento
Membrana de nitrocelulose	Fisher Scientific	45004091	Usado para western blotting
Penicilina-estreptomicina	Gibco	15140122	Usado para cultura
pH Meter	Mettler Toledo	Seven compact s210	Usado para monitorar o pH de soluções
Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)	Sigma-Aldrich	P7626	Usado como componente do tampão
Phosphate Buffer Saline	Sigma-Aldrich	D8537	Usado para cultura
PKCδ pThr505	Tecnologia de sinalização celular	9374	Usado como anticorpo primário para western blotting
Sepharose Protein G	Generon	PG50-00-0002	Used for immunoprecipitation
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653	Usado como componente do tampão de lavagem
cloreto de sódio
Sigma-Aldrich	S6508	Usado como componente do tampão
Sodium Pyruvate	Sigma-Aldrich	S8636	Usado para cultura
sódio-β-glicerofosfato	Merck UK	G9422	Usado como componente do tampão
Staurosporine (de Streptomyces sp.)	Scientific Laboratory Supplies, UK	S4400-1MG	Usado para experimento
Sacarose	Scientifc Laboratory Supplies	S0389	Usado como componente do tampão
TEMED	Sigma-Aldrich	T7024	Usado para fazer gel de separação e empilhamento para SDS-PAGE
Transfer Chamber	BioRad	1658005EDU	Usado em western blotting para transferir proteínas na membrana
Tris	Sigma-Aldrich	T6066	Usado para fazer gel de separação e empilhamento para SDS-PAGE
Triton-X100	Sigma-Aldrich	T8787	Usado como componente do tampão
Solução de tripsina-EDTA	Merck Life Sciences UK	T4049	Usado para cultura de
Tween-20	Sigma-Aldrich	P3179	Usado como fazer TBS-T buffer
Bomba de vácuo	Charles Austen	Dymax 5	Usado para cultura de
Vortex	Scientific Industries	K-550-GE	Usado na preparação de
Vortex mixer	Scientific Industries Ltd	Vortex-Genie K-550-GE	Usado para misturar amostra
Banho-maria	Grant Instruments Ltd. (JB Academy)	JBA5	Usado para incubar soluções