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Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Quantificação de células ganglionares da retina somas
NOTA: O procedimento a seguir é para quantificação de somas RGC, com base na coloração imuno-histoquímica de montagens planas da retina com um anticorpo contra a proteína 3A do domínio homeobox/POU específica do cérebro (Brn3a).
- Transfira retinas isoladas para uma placa de cultura de 24 poços (uma retina por poço) contendo 1 mL de 1x PBS e mantenha a retina interna voltada para cima.
- Permeabilize o tecido lavando 3x por 10 min com um surfactante não iônico 0,5% diluído em 1x PBS (0,3 mL). Em seguida, mantenha o tecido agitando suavemente em albumina de soro bovino (BSA) a 5% em surfactante não iônico 2% e 1x PBS (solução bloqueadora; 0,25 mL) por 60 min em temperatura ambiente.
- Durante a etapa 1.2, prepare a solução de anticorpo primário Brn3a diluindo 1:200 em surfactante não iônico 0,5% e 1x PBS mais 5% BSA e armazene-o a 4 °C.
- Após 60 min de bloqueio tecidual, incube as retinas em 0,2 mL de solução de anticorpo primário a 4 °C por 72 h com agitação suave.
- Lave o tecido 3x por 10 min com 1x PBS, depois incube o tecido por 2 h em temperatura ambiente em 0,2 mL da solução de anticorpo secundário diluída 1:750 em 1x PBS mais 5% BSA.
- Além disso, incube o tecido por 10 min em solução de contracoloração nuclear para coloração de núcleos fluorescentes. Conclua a imuno-histoquímica com uma etapa final de lavagem com 1x PBS (0,3 mL) repetido 3x.
- Transfira as retinas com o auxílio de duas pequenas escovas para lâminas de microscópio de vidro, mantendo o lado vítreo para cima. Posicione o quadrante dorsal da retina nas lâminas do microscópio. Faça mais dois cortes radiais em direção à cabeça do nervo óptico para delimitar os outros 3 quadrantes (nasal, ventral e temporal).
NOTA: As dimensões de corte não são fixas. Eles não devem ser muito curtos que prejudiquem um achatamento eficiente da retina na lâmina e não devem ser muito longos para atingir o forame do nervo óptico e separar completamente o quadrante retiniano delimitado do resto do tecido. - Finalmente, aplique 0,2 mL de meio de montagem antidesbotamento em uma lamínula de vidro e coloque-a na retina plana para análise microscópica do tecido. Para estimar a densidade dos RGCs, examine as montagens planas sob um microscópio de epifluorescência confocal usando uma objetiva de 40x/1,3.
- Para cada quadrante da retina, tire oito fotos: duas da retina central (~0,9 mm do disco óptico), três da retina média (~2,0 mm do disco óptico) e três da retina periférica (~3,7 mm do disco óptico), totalizando 32 fotos por retina. Use o software FIJI para contar células Brn3a-positivas e estimar a densidade celular média.