O vídeo demonstra uma técnica ex vivo para estimular o sistema nervoso intracardíaco para avaliar a suscetibilidade do coração à arritmia. Usando um aparelho de perfusão, um coração de camundongo isolado é perfundido com um tampão oxigenado. O sistema nervoso intracardíaco é então estimulado em alta frequência para induzir arritmias.
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Artigo de método
Estimulação do Sistema Nervoso Intracardíaco para Avaliar a Suscetibilidade à Arritmia
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28 de abril de 2025
Neste artigo
Resumo
Protocolo
Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Preparação do Aparelho de Langendorff
NOTA: Um sistema de perfusão Langendorff disponível comercialmente é usado.
- Prepare uma solução de Krebs-Henseleit modificada (119 mM de cloreto de sódio, 25 mM de bicarbonato de sódio, 4,6 mM de cloreto de potássio, 1,2 mM de fosfato de potássio monobásico, 1,1 mM de sulfato de magnésio, 2,5 mM de cloreto de cálcio, 8,3 mM de glicose e 2 mM de piruvato de sódio). Para evitar a precipitação de cálcio, adicione uma mistura de 95% de oxigênio / 5% de dióxido de carbono à solução de perfusão. Filtrar o tampão com um tamanho de poro de 0,22 μm.
- Adicione um agente farmacológico ao tampão para investigar seu efeito na eletrofisiologia cardíaca e na arritmogênese, conforme necessário.
- Inicie o banho-maria e coloque a solução de perfusão incluindo uma mistura de 95% de oxigênio/5% de dióxido de carbono. Ajuste a temperatura do banho-maria, de modo que a temperatura da solução de perfusão diretamente antes da cânula seja de ~ 37 °C.
- Assim que a temperatura correta for atingida, ligue a bomba de rolos e encha o aparelho com a solução de perfusão.
- Ajuste a taxa de bombeamento antes de conectar o coração, para que não fiquem bolhas de ar na cânula ao montá-la no aparelho.
2. Preparação
- de hardware e softwareConecte um sistema digital de aquisição de dados e seu software correspondente ao aparelho Langendorff para um registro contínuo da pressão de perfusão, vazão e frequência cardíaca.
- Defina a pressão de perfusão desejada nas configurações gerais para 80 mmHg.
- Iniciar gravação.
- Para registro de dados e estimulação com um gerador de estímulo digital designado, use um cateter de eletrofisiologia com eletrodos de platina, uma superfície de eletrodo de 0,5 x 0,5 mm e um espaçamento de eletrodo de 0,5 mm.
- Coloque o cateter próximo à área onde o coração será posicionado após a fixação ao aparelho.
- Prepare a estimulação selecionando 2 eletrodos do cateter e use uma duração de ciclo de 100 ms.
3. Preparação do Heart
- Adicione o tampão de perfusão frio (~2 - 4 °C) (10 - 20 mL e 40 - 50 mL, de modo que toda a placa fique coberta) às 2 placas de Petri (diâmetros de 6 cm e 10 cm) e à placa com a cânula, e coloque-as no gelo diretamente ao lado e sob o microscópio. Prepare um nó duplo ao redor da cânula.
- Extirpe rapidamente o coração após a luxação cervical, abrindo o tórax usando uma tesoura Mayo e uma pinça de padrão estreito. Em seguida, segure a aorta e a veia cava acima do diafragma usando a pinça de London e excise o bloqueio coração-pulmão cortando todos os vasos e tecido conjuntivo próximo à coluna com a tesoura de estrabismo.
- Transfira o bloco coração-pulmão para o primeiro prato (6 cm de diâmetro) preenchido com o tampão gelado e remova cuidadosamente os pulmões sem danificar o coração usando uma tesoura de estrabismo e uma pinça de Londres. Em seguida, coloque o coração sob o microscópio e remova cuidadosamente o timo, o esôfago e a traqueia usando uma tesoura de mola e uma pinça Dumont SS.
- Use a tesoura de mola para cortar um orifício de 1,5 a 2 mm na parte superior do átrio direito para a inserção do cateter. Faça um buraco na artéria pulmonar. Em seguida, corte a aorta diretamente sob os ramos supra-aórticos e remova o tecido para que o nó possa ser fixado facilmente.
- Mantenha intactas as bolsas de gordura atrial, incluindo os principais plexos ganglionares localizados atrialmente, ao redor do átrio esquerdo ou remova-as completamente por dissecação cuidadosa.
- Transfira o coração para o prato com a cânula e coloque-o sob o microscópio. Puxe a aorta sobre a cânula com a pinça Dumont SS e amarre o nó preparado firmemente ao redor da aorta. Certifique-se de que a cânula não seja colocada muito fundo na aorta para que a válvula aórtica e os vasos coronários fiquem livres.
- Conecte a cânula rapidamente ao aparelho de Langendorff. Certifique-se de que não haja bolhas na cânula.
- Mude a pressão de perfusão para 80 mmHg, permitindo uma perfusão de pressão constante.
- Insira o cateter cuidadosamente no átrio direito e no ventrículo direito sem tocar ou danificar o coração e prenda-o à cânula com fita adesiva.
- Inicie a estimulação com a duração do ciclo preparada de 100 ms para um período inicial de equilíbrio de 20 minutos.
- Feche a câmara para permitir uma temperatura estável.
4. Parâmetros eletrofisiológicos e arritmogênese
- Aplique estimulação programada através dos eletrodos distal ou proximal do cateter com o dobro do limiar de estimulação atrial ou ventricular para avaliar os parâmetros eletrofisiológicos, conforme descrito nas etapas a seguir.
- Determine o tempo de recuperação do nó sinusal como a duração máxima do ciclo de retorno após 10 s de estimulação de taxa fixa em uma duração de ciclo S1S1 de 120 ms, 100 ms e 80 ms.
- Determine o ponto de Wenckebach como a maior duração do ciclo S1S1 (8 estímulos; S1S1: 100 ms; redução gradual de 2 ms) com perda de 11 condução nodal AV. Determinar os períodos refratários do nó atrioventricular como o S1S2 mais longo (12 estímulos; S1S1: 120 ms, 110 ms e 100ms; um extraestímulo acoplado curto com uma redução gradual de S1S2 de 2 ms) com perda de condução nodal AV.
- Determine os períodos refratários atriais e ventriculares como o S1S2 mais longo (12 estímulos; S1S1: 120 ms, 110 ms e 100ms; um extraestímulo acoplado curto com uma redução gradual de S1S2 de 2 ms) com uma resposta atrial ou ventricular ausente.
- Realize uma extraestimulação programada (S1S1: 120 ms, 100 ms e 80 ms, seguida de até 3 batimentos extras; 60 - 20 ms com uma redução gradual de 2 ms) ou protocolos de estimulação burst (5 s em S1S1: 50 - 10 ms com uma redução gradual de 10 ms) de acordo com as Convenções de Lambeth para avaliar a arritmogênese ventricular.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Sodium chloride | Solução de Krebs-Henleit modificada< | ||
| Cloreto de potássio | Solução Krebs-Henleit modificada< | ||
| Sulfato de magnésio heptahidratado | |||
| Cloreto de cálcio di-hidratado | |||
| Glucose | Solução de Krebs-Henleit modificada< | ||
| Carbogen (95% de oxigênio / 5% de dióxido de carbono) | |||
| Sistema de aquisição de dados e software correspondente para cateter e parâmetro fisiológico< | |||
| Octapolar catheter | |||
| Stimulus generator | |||
| Stimulation software | |||
| Plastic Wrap | |||
| Spring scissors | |||
| Strabismus Scissors | |||
| Mayo Scissors | |||
| Dumont SS Forceps | |||
| London Forceps | |||
| Narrow Pattern Forceps |
