Indução de Traumatismo Cranioencefálico Leve em Modelo de Camundongo

Resumo

Fonte: Macheda, T., et. al. Modelo de cabeça fechada controlado eletromagnética de lesão cerebral traumática leve em camundongos. J. Vis. Exp. (2022)

Este vídeo demonstra o procedimento para induzir um traumatismo craniano fechado em um modelo de camundongo usando um quadro estereotáxico. O impacto controlado replica lesões cerebrais traumáticas leves, permitindo que os pesquisadores estudem os efeitos neurológicos e a recuperação medindo os reflexos e o comportamento pós-lesão.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Procedimento cirúrgico

1. Prenda o mouse na estrutura estereotáxica usando barras auriculares de ponta cônica de resina acetal leve, uma barra de mordida e uma máscara de anestesia de camundongo (ver Figura 1G, H). O gás isoflurano é fornecido a 2% -3% em ar ambiente a 100-200 mL / min. Monitore cuidadosamente a respiração do mouse para garantir a profundidade da anestesia e ajuste o nível de gás conforme necessário.
2. Aplique lubrificante ocular estéril nos olhos para evitar o ressecamento da córnea.
3. Esterilize o couro cabeludo com cotonetes de iodopovidona e compressas de álcool estéreis três vezes.
4. Certifique-se de que o mouse esteja profundamente anestesiado, verificando a falta de uma resposta de pinça do dedo do pé.
5. Faça uma incisão no couro cabeludo na linha média de aproximadamente 1 cm entre os olhos e o pescoço usando um bisturi, expondo o crânio (ver Figura 1I).
6. Deixe o crânio secar por 1-2 min.
7. Identifique bregma (o ponto de interseção das suturas coronal e sagital) e lambda (a interseção das suturas sagital e lambdoide) (ver Figura 1J).
   NOTA: Um atlas do cérebro de camundongo pode ser usado como referência.
8. Coloque o aparelho de apoio de cabeça sob a cabeça e infle o bulbo com água até que ele pressione a parte inferior da cabeça do mouse, mas não levante a cabeça para longe da barra de mordida.
   NOTA: Esta etapa é essencial para reduzir possíveis problemas de ouvido causados pela lesão na cabeça fechada (CHI). Qualquer animal com danos na orelha causados pelas barras auriculares, resultando em rolamento ou sangramento, deve ser eliminado do estudo e sacrificado.
9. Mova o impactor para o lugar sobre a cabeça do animal.
10. Estenda o pêndulo colocando a chave seletora Estender/Retrair (na caixa de controle do impactor) na Estender.
    NOTA: Certifique-se de verificar se a ponta está totalmente estendida puxando a ponta para baixo.
11. Alinhe o impactor até que ele esteja centralizado sobre o bregma (consulte a Figura 1K).
12. Redefina as coordenadas x e y estereotáxicas digitais no leitor estereotáxico para 0 (no controle da tela sensível ao toque)
13. Alinhe a sonda sobre o local do impacto movendo a sonda do bregma para as coordenadas alvo: medial-lateral = 0,0 mm, ântero-posterior = −1,6 mm.
14. Prenda o sensor de contato na orelha do animal.
    1. Abaixe lentamente a ponta da sonda com a sonda estendida até que o primeiro contato com a superfície seja feito. Pare no bipe.
    2. Redefina as coordenadas z estereotáxicas digitais no leitor estereotáxico para 0.
15. Inspecione cuidadosamente se a ponta está nivelada com o crânio (planos medial-lateral e ântero-posterior).
    NOTA: O posicionamento da ponta da sonda é a etapa mais crucial desse processo para evitar fraturas no crânio e danos aos ouvidos.
16. Retrair o impactor colocando o interruptor de alternância na caixa de controle na posição Retrair. A ponta se retira e não tem mais contato com a cabeça do animal até o momento do impacto.
17. Defina a profundidade do impacto ajustando a profundidade dorsal-ventral para −1,2 mm.
    NOTA: A profundidade do impacto afeta a gravidade da lesão. A profundidade deve ser titulada para diferentes idades, pesos e linhagens de camundongos para a gravidade desejada da lesão. A profundidade pode precisar ser ajustada/retitulada ao longo do tempo para manter uma gravidade consistente da lesão. A gravidade pode ser avaliada neuropatologicamente: micróglia e astrócitos (Imuno-histoquímica (IHQ)) e comportamentalmente: o labirinto de água do braço radial e o teste de evitação ativa.
18. Monitore cuidadosamente a respiração do mouse para garantir a profundidade da anestesia e ajustar o nível de gás conforme necessário.
    NOTA: Freqüentemente, a porcentagem de gás isoflurano deve ser reduzida ou desligada por 10-20 s antes do impacto. Observe atentamente se a respiração acelera ligeiramente. Se a respiração for muito lenta no momento do impacto, o animal pode morrer nos primeiros 60 segundos após o impacto da apneia. Isso pode ser evitado ajustando a profundidade da anestesia nos segundos anteriores ao impacto.
19. Induza o impacto pressionando o botão de alternância direito para impactar. A ponta da sonda desce na velocidade exibida e, em seguida, permanece abaixada pelo tempo de permanência definido e se retrai.
    NOTA: Os mouses simulados recebem manuseio idêntico aos mouses CHI, mas o impacto não é entregue.
20. Inicie o cronômetro imediatamente após o impacto do CHI ser entregue para registrar os tempos de endireitamento (tempo para retornar da posição lateral para a posição deitada) ou inicie o cronômetro quando o mouse for removido do quadro estereotáxico para os camundongos falsos. O tempo médio do reflexo de endireitamento é de 5 a 15 min.
    NOTA: Os tempos de reflexo de endireitamento podem variar de acordo com a tensão e a idade do mouse.
21. Avalie os camundongos quanto a fraturas visíveis no crânio, hemorragias e apneia. Exclua os camundongos com fratura craniana deprimida ou hemorragia visível do estudo.
    NOTA: Existem níveis graduais de fraturas cranianas. Animais com fraturas cranianas descomprimidas, onde o osso está visivelmente pressionando o tecido cerebral, são sacrificados (CO₂ primeiro, e a decapitação é usada como método secundário). Se a ponta do impactor for ajustada corretamente, esses tipos de fraturas cranianas são extremamente raros. Se ocorrer uma fratura no crânio, a apresentação mais comum é uma pequena gota de sangue no crânio e uma leve rugosidade tátil do crânio, geralmente ao longo da sutura que conecta a ponta posterior do osso nasal. Esses camundongos são anotados como possíveis fraturas cranianas nos registros, mas normalmente não são excluídos do estudo.
22. Remova o animal do quadro estereotáxico.
23. Feche o couro cabeludo grampeando a pele.
    NOTA: Suturas absorvíveis ou não absorvíveis podem ser usadas para fechar o couro cabeludo como alternativa aos grampos.
24. Aplique pomada antibiótica tripla com um aplicador estéril com ponta de algodão na incisão fechada.
25. Retorne o mouse a uma gaiola de retenção limpa para recuperação. Metade da gaiola de recuperação está em uma almofada de aquecimento (configuração baixa), proporcionando a capacidade de se afastar do calor quando acordado e manter a temperatura do animal enquanto inconsciente (ver Figura 1L).
    NOTA: O mouse é colocado de lado no compartimento de recuperação. Para evitar asfixia, coloque o animal em uma gaiola de recuperação sem cama ou em um lenço de papel se houver cama na gaiola.
26. Retorne a chave seletora Estender/Retrair para a posição Central/Desligada.
    NOTA: A corrente continuará funcionando se a chave for deixada na posição de extensão ou retração, fazendo com que o pistão inche. O impactor não funcionará até que o pistão esfrie.
27. Remova o pêndulo de seu suporte e coloque-o suavemente na bolsa de gelo.
    NOTA: Manter o impactor em uma bolsa de gelo ajuda a reduzir o inchaço potencial do impactador.
28. Monitore o animal até que ocorra o reflexo de endireitamento e documente o tempo até o endireitamento (consulte a Figura 1M).
    NOTA: O reflexo de endireitamento é definido como o momento em que o mouse retorna à posição de bruços. A gaiola precisa ser deixada intacta; O mouse pode se acertar se a gaiola for tocada, movida ou exposta a alguns ruídos.
29. Devolva os ratos à gaiola de origem quando estiverem acordados e alertas. Normalmente, dentro de 1 h após a lesão, os animais estão totalmente conscientes e deambulando. Além disso, adicione um pouco de comida úmida no fundo da gaiola.

Resultados

Figura 1: Etapa 1: Configuração da área cirúrgica. (A) Um exemplo da área cirúrgica e das ferramentas necessárias para realizar a cirurgia de CHI (bolsa de gelo para o impactor, estrutura estereotáxica equipada com o impactor, caixa de controle do impactor e ferramentas cirúrgicas) é mostrado. (B) Uma visão aproximada da ponta da sonda de ...

Materiais

< classe de figura='tabela' estilo='largura::753pt;'>td style='width:190pt;'>Head support apparatus para cirurgia < estilo td = 'altura: 14,5pt; largura: 283pt; '> isoflurano, USP < estilo td = 'largura: 149pt; '> Covetrus < estilo td = 'largura: 131pt; '>NDC: 11695-6777-2 < estilo td = 'largura: 190pt; '> Cirurgia< estilo td = 'altura: 14,5 pt; largura: 283pt; '> cabeça de anestesia com gás de camundongo holder de apoio de cabeça < estilo td = 'largura: 190pt; '> RAWM < estilo td = 'altura: 15,75 pt; largura: 283pt; '> escala < estilo td = 'largura: 149pt; '> série OHAUS CS < estilo td = 'largura: 131pt; '> BAL-101 < estilo td = 'largura: 190pt; '> preparação para cirurgia < estilo td = 'altura: 15,75 pt; largura: 283pt; '>Cabo de bisturi # 7 sólido 6,25 "td style='width:190pt;'>Surgery prepCreme anestésico tópico

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
9 mm Autoclip Applier	Braintree scientific	ACS- APL	Surgery
9 mm Removedor de clipe automático	Braintree scientific	ACS- RMV	Surgery
9 mm Autoclip, caixa de 1.000 clipes	Braintree scientific	ACS- CS	Surgery (Staples)
Software Aperio ImageScope	Leica BioSystems	NA	IHC
BladeFLASK Blade Remover	Fisher Scientific	22-444-275	Surgery
Aplicador de ponta de algodão	VWR	89031-270	Surgery
Digitial mouse stereotaxic frame	Stoelting	51730D	Surgery
Dumont #7 Forceps	Roboz	RS-5047	Surgery
Barras auriculares	Stoelting	51649	Surgery
EthoVision XT 11.0	Noldus Information Technology	NA	RAWM
Fiber-Lite	Dolan-Jeffer Industries	UN16103-DG	Surgery
Fisherbrand Bulb for Small Pipets	Fisher Scientific	03-448-21<
Gemini Avoidance System	San Diego Instruments	NA	Active avoidance
Heating Pad	Sunbeam	732500000U	Surgery prep
HRP conjugated goat anti-rabbit IgG	Jackson Immuno Research laboratories	111-065-144	IHC
câmara de indução	Kent Scientific	VetFlo-0530XS	preparação
Stoelting	51609M	Surgery
Neuropactor Stereotaxic Impactor	Neuroscience Tools	n/a	Surgery: Formalmente distribuído pela Lecia como impact one
NexGen Mouse 500	Allentown	n/a	Pós-cirurgia, segurando a gaiola
Parafilm	Bemis	PM992	Aparelho
Peanut - Máquina de cortar cabelo profissional	Whal	8655-200	Surgery prep
Povidone-Iodine Solution USP, 10% (m/v), 1% (p/v) disponível Iodo, para laboratório	Ricca	3955-16	Surgery
Puralube Vet Oinment, petrolatum ophthalmic	Dechra	17033-211-38	Surgery
Rabbit anti-GFAP	Dako	Z0334	IHC
Rabbit anti-IBA1	Wako	019-19741	IHC
Labirinto de água de braço radial de 8 braços	MazeEngineers	n / a
Roboz	RS-9847	Surgery
Almofadas de preparação de álcool estéril (álcool isopropílico 70% v/v)	Fisher Brand	22-363-750<
SumnoSuite low-flow anesthesia system	Kent Scientific	SS-01	Surgery
10 mL seringa Luer-Lok Tip	BD Bard-Parker	302995	Head support apparatus
Timers	Fisher Scientific	6KED8	Surgery
L.M.X 4	NDC 0496-0882-15	Surgery prep
Triple antibiotic ointment	Major	NDC 0904-0734-31	Post-surgery
Tubing	MasterFlex	96410-16	Head support apparatus
Vaporizer Single Channel Anesthesia System	Kent Scientific	VetFlo-1210S	Preparação para cirurgia