Análise da dinâmica do cálcio e alterações do potencial de membrana em um endotélio arteriolar de camundongo

Resumo

Fonte: Hakim, M. A. et al., Isolamento e Análise Funcional do Endotélio Arteriolar do Parênquima Cerebral de Camundongo. J. Vis. Exp. (2022).

Este vídeo demonstra a análise funcional de um tubo endotelial arteriolar isolado de um cérebro de camundongo. Ele descreve as etapas para medir os níveis de cálcio intracelular e o potencial de membrana, tanto na linha de base quanto em resposta à estimulação farmacológica.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pela ética animal apropriada comitê de revisão.

1. Materiais e equipamentos

OBSERVAÇÃO: Consulte o Tabela de Materiais para todos os reagentes e materiais necessários para este protocolo. Além disso, manuais e sites associados aos respectivos fornecedores também podem ser consultados conforme necessário.

1. Flow chamber
   1. Prenda uma câmara de superfusão com uma lamínula de vidro em uma plataforma composta de alumínio anodizado. Prenda a plataforma com a câmara em um microscópio de alumínio platina.
   2. Coloque um micromanipulador segurando uma pipeta de fixação em cada extremidade da plataforma no microscópio de alumínio
      NOTE: Se necessário, use um aparelho de platina transferível com uma unidade de câmara de fluxo para mover um tubo endotelial seguro e isolado de um aparelho de microscópio para outro para experimentação.
2. Microscópios
   1. Configure o aparato experimental organizando um microscópio invertido (objetivas: 4x, 10x, 20x, 40x e 60x) e uma platina manual de alumínio em uma mesa de isolamento de vibração.
3. Intracellular V_m equipamento de gravação
   1. Conecte o eletrômetro a um headstage compatível. Use acessórios, como gerador de função e estimulador, para protocolos que requerem injeção de corrente.
   2. Conecte as saídas do amplificador a um sistema digitalizador de dados, osciloscópio e monitores de linha de base audíveis. Fixe o eletrodo de banho de referência (pellet Ag/AgCl) próximo à saída da câmara de fluxo.
   3. Monte um sistema fotométrico com componentes integrados de uma interface de sistema de fluorescência, lâmpada de arco de alta intensidade e fonte de alimentação, hiperinterruptor, tubo fotomultiplicador (ou PMT) e câmera para medir [Ca²⁺]_i em células endoteliais.
   4. Monte um controlador de temperatura equipado com um aquecedor em linha para aumentar e manter uma temperatura fisiológica (37 °C) durante todo o experimento.
   5. Monte uma plataforma multicanal conectada a um controlador de válvula com uma válvula de controle de fluxo em linha para controlar a entrega de soluções aos tubos endoteliais fixados na câmara.
4. Micropipetas e eletrodos afiados
   NOTA:<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'> O experimentador precisará de um extrator de vidro eletrônico e uma microforja para preparar a fixação Pipetas.
   1. Para fixar o tubo endotelial na câmara de superfusão, prepare pipetas de fixação polidas a quente com uma extremidade esférica embotada (diâmetro externo: 50-70 μm) preparadas a partir de capilares de vidro borossilicato de parede fina.
   2. Para gravar o V_m de uma célula endotelial, prepare eletrodos afiados com uma resistência de ponta de ~ 150 ± 30 MΩ de capilares de vidro usando apenas o extrator de vidro.

2. Soluções e drogas

1. Solução salina fisiológica (PSS)
   1. Prepare um mínimo de 1 L de PSS usando 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ácido etanossulfônico (HEPES) e 10 mM de glicose.
   2. Prepare as soluções necessárias sem CaCl₂ (zero Ca²⁺ PSS) para dissecção de arteríolas cerebrais e isolamento de endotelial Tubos.
      NOTA: Preparar tudo soluções em H style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>₂O, seguido de filtração (0,22 μm). Certifique-se de que o produto final contém um pH 7,4 com osmolalidade entre 290 e 300 mOsm.
2. Fura-2 e agentes farmacológicos
   1. Prepare o estoque Fura-2 AM em dimetilsulfóxido (DMSO; 1 mM). Prepare 500 μL de concentração de trabalho (10 μM) adicionando 5 μL do estoque a 495 μL de PSS para carregamento.
   2. Prepare pelo menos 50 mL de concentrações de trabalho de agentes farmacológicos em PSS ou DMSO, conforme apropriado.
3. Solução condutora
   1. Prepare 2 M KCl dissolvendo KCl em H₂O (7.455 g de KCl em 50 mL de H₂O). Passe a solução por uma seringa com um filtro de 0,22 μm antes de preencher os eletrodos afiados.

3. Utilização de tubos endoteliais arteriolares para o exame da fisiologia celular

NOTE:<span style='font-family:Arial,sans-serif; tamanho da fonte:12pt; estilo da fonte:normal; variante de fonte: normal; peso da fonte: 400; decoração de texto:nenhuma; alinhamento vertical:linha de base; espaço em branco: pré-encapsulamento;' > Tubos endoteliais arteriolares isolados e protegidos podem ser usados para gravações intracelulares de [Ca²⁺]_i dynamics and V_m usando fotometria e eletrodo afiado eletrofisiológico, respectivamente, conforme ilustrado anteriormente (Figura 1). [Ca²⁺]_i e V_m podem ser medidos como variáveis experimentais separadas ou combinadas (Figura 1). No entanto, os tubos endoteliais arteriolares são mais delicados que o endotélio arterial, e o tempo de experimentação não deve exceder 1 h.

1. Medição de [Ca²⁺]_i
   1. Ligue o equipamento e o software para [Ca²⁺]_i gravações enquanto mantém a superfusão contínua a uma taxa de fluxo de 5-7 mL/ Min.
   2. Carregue o tubo endotelial com o Ca²⁺ tingir Fura-2 AM por 30 min em temperatura ambiente. Lavar as células com solução de superfusão durante mais 20-30 minutos, elevando gradualmente a temperatura do banho para 37 °C. Manter a temperatura a 37 °C durante toda a experiência.
   3. Ajuste manualmente a janela de imagem usando o software de fotometria para focar em ~ 20 células endoteliais (Figura 1A). Na ausência de luz, ligue o PMT na interface de fluorescência e inicie a aquisição de [Ca²⁺]_i excitando o Fura-2 alternadamente (≥10 Hz) a 340 nm e 380 nm enquanto coleta a emissão de fluorescência a 510 nm. Uma vez que uma gravação de linha de base estável de [Ca²⁺]_i for estabelecido, aplique agentes farmacológicos (por exemplo, receptor purinérgico agonistas) de acordo com o objetivo experimental (Figura 1B).
2. Medição de V_m
   1. Ligue o equipamento e o software para V_m gravações e defina a taxa de aquisição de dados (≥10 Hz), mantendo a superfusão contínua a uma taxa de fluxo de 5-7 mL / min. Aumentar gradualmente a temperatura do banho para 37 °C e mantê-la até ao final da experiência.
   2. Puxe um eletrodo afiado usando um capilar de vidro borossilicato, preencha com 2 M KCl e prenda-o sobre um fio de prata revestido com cloreto no porta-pipetas conectado a um eletrômetro que, por sua vez, é segurado por um micromanipulador.
   3. Ao visualizar através da objetiva 4x, use um micromanipulador para posicionar cuidadosamente a ponta afiada do eletrodo logo acima de uma célula do tubo endotelial arteriolar no PSS que flui na câmara.
   4. Aumente gradualmente a ampliação para 400x e reposicione a ponta do eletrodo conforme necessário.
   5. Usando o micromanipulador, insira suavemente a ponta de um eletrodo afiado em uma das células do tubo endotelial e comece a gravar V_m usando um eletrômetro (Figura 1A).

Uma vez que o endotélio em repouso V_m é estável (−30 a −40 mV), aplique o farmacológico desejado agentes por objetivo experimental (Figura 1C).

Resultados

Figura 1: Aplicação de tubo endotelial para exame fisiológico de vias relacionadas à regulação do fluxo sanguíneo. (A) Um eletrodo afiado (seta roxa) é posicionado em uma célula de um tubo endotelial focado na janela de aquisição de dados para fotometria. (B) Registro representativo de Ca²⁺ intracelular usando fotometria Fura-2 em resposta ao MTA (1 μM). (

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Amplifiers	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Monitores de linha de base audíveis	Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA	BM-A-TM
Bath Chiller (Isotemp 500LCU)	ThermoFisher Scientific	13874647
Capilares de vidro borosilicato (Pinning)	Warner Instruments	G150T-6
Capilares de vidro borosilicato (Sharp Electrodes)	Warner Instruments	GC100F-10
BSA: Albumina de soro bovino	Sigma	A7906
CaCl2: Cloreto de cálcio	Sigma	223506
DMSO: Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D8418
Válvula de controle de fluxo	Warner Instruments	FR-50
Interface do sistema de fluorescência, lâmpada ARC & fonte de alimentação, hiperinterruptor e PMT	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA	Sistemas IonOptix
Function Generator	EZ Digital, Seul, Coreia do Sul	FG-8002
Fura-2 AM dye	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	F14185
Glucose	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA)	G7021
HCl: Ácido Clorídrico	ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, EUA)	A466250
Headstages	Molecular Devices	HS-2A & HS-9A
HEPES: (4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico)	Sigma	H4034
Aquecedor de Solução em Linha	Warner Instruments	SH-27B
KCl: Cloreto de Potássio	Sigma	P9541
MgCl2: Cloreto de Magnésio	Sigma	M2670
Microforge	Narishige, East Meadow, NY, EUA	MF-900
Micromanipulador	Siskiyou	MX10
Extrator de micropipeta (digital)	Sutter Instruments, Novato, CA, EUA	P-97 ou P-1000
Microscópio (Nikon invertido)	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, EUA	Ts2
Microscópio ( Nikon invertido)	Nikon Instruments Inc	Eclipse TS100
Objetivas de microscópio	Nikon Instruments Inc	20X (S-Fluor) e 40X (Plan Fluor)
Plataforma de microscópio (alumínio anodizado; diâmetro, 7,8 cm)	Warner Instruments	PM6 ou PH6
Microscope Stage (Alumínio)	Siskiyou, Grants Pass, OR, EUA	8090P
MTA: 2-Metiltioadenosina difosfato sal trissódico	Tocris	1624
NaCl: Cloreto de sódio	Sigma	S7653
NaOH: Hidróxido de sódio	Sigma	S8045
Osciloscópio	Tektronix, Beaverton, Oregon, EUA	TDS 2024B
Objetivas de contraste de fase	Nikon Instruments Inc	(Ph1 DL; 10X & 20X)
Câmara de superfusão de plexiglas	Warner Instruments, Camden, CT, USA	RC-27
Stereomicroscopes	Zeiss, NY, USA	Stemi 2000 & 2000-C
Filtro de seringa (0.22 μm)	ThermoFisher Scientific	722-2520
Controlador de Temperatura (Dual Channel)	Warner Instruments	TC-344B ou C
Sistema de Controle de Válvulas	Warner Instruments	VC-6
Mesa de Isolamento de Vibração	Fabricação Técnica, Peabody, MA, USA	Micro-g