Avaliação dos níveis de neurotransmissores excitatórios em ratos induzidos por epilepsia crônica

Resumo

Fonte: Soukupová, M., et al. Microdiálise de aminoácidos excitatórios durante registros de EEG em ratos em movimento livre. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra a avaliação dos níveis de neurotransmissores excitatórios extracelulares em ratos com indução de epilepsia crônica. Após a implantação de uma sonda de microdiálise no cérebro e a confirmação da ausência de convulsões por meio de eletroencefalografia (EEG), o fluido extracelular é coletado para avaliar níveis elevados de neurotransmissores em ratos epilépticos. Uma solução com alto teor de potássio é então infundida para sustentar a excitabilidade neuronal e desencadear uma liberação aumentada de neurotransmissores, com amostras coletadas para avaliar o pico induzido por potássio em neurotransmissores excitatórios.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

Este protocolo é especificamente ajustado para determinação de glutamato e aspartato em dialisados cerebrais de ratos obtidos sob controle de EEG de sessões de microdiálise em ratos epilépticos e não epilépticos. Muitos dos materiais descritos aqui podem ser facilmente substituídos por aqueles que se usa em seu laboratório para registros de EEG ou microdiálise.

1. Montagem do dispositivo de eletrodo de sonda de microdiálise

1. Use um eletrodo de 3 canais de duas torções (com pelo menos 20 mm de comprimento de corte do eletrodo de registro e um eletrodo de aterramento de 10 cm de comprimento) e acople-o a uma cânula guia para preparar o dispositivo. Veja exemplos de eletrodo de 3 canais e cânula guia para diálise em Figura 1A-1B.
2. Remova (Figura 1C) e insira (Figura 1D) a cânula guia de metal na cânula plástica fictícia algumas vezes antes do uso para facilitar sua remoção no momento de sua troca para sonda de microdiálise em animais.
3. Dobre os fios torcidos do eletrodo de registro duas vezes (Figura 1E-1F) para alinhar os fios com a cânula fictícia da guia e corte a ponta do eletrodo (Figura 1G) para ser 0,5 mm mais longa que a ponta da cânula guia (Figura 1H) usando o paquímetro digital.
4. Prepare a argola de silicone de 1 mm de comprimento (OD 2 mm, espessura 0,3 mm; Figura 1I) e insira a ponta da cânula guia e a ponta dos eletrodos torcidos na argola de silicone usando a pinça (Figura 1J). Fixe-o no pé do pedestal da cânula guia com cola de polímero de ação rápida ou resina (Figura 1K). Veja o exemplo dos dispositivos concluídos em Figura 1L e Figura 2A.
5. Esterilize o dispositivo sob luz UV germicida por 4 h. Vire o dispositivo quatro vezes para que cada um de seus lados fique exposto à luz por 1 h.
   Nota: Muitos eletrodos caseiros e sondas de microdiálise podem ser montados de maneira semelhante. A cabeça do implante acima descrito para ratos tem as seguintes dimensões: 7 mm de largura x 5 mm de profundidade x 10 mm de comprimento do topo ao pedestal; A ponta do implante tem cerca de 11 mm de comprimento, 600 μm de diâmetro e todo o dispositivo pesa cerca de 330-360 mg. O dispositivo pode ser reutilizado duas ou três vezes se i) for deixado no crânio um comprimento suficiente do eléctrodo de massa durante a cirurgia para a utilização seguinte e ii) quando o animal for abatido e o dispositivo recuperado juntamente com o cimento dentário for deixado em acetona durante a noite, de modo a que o cimento possa ser desagregado mecanicamente, e o dispositivo lavado e esterilizado novamente.

2. Cirurgia Estereotáxica

1. Use um aparelho estereotáxico e suporte de clipe de sonda (Figura 2B) para a implantação do dispositivo seguindo os padrões contemporâneos para cirurgias assépticas e sem dor.
   1. Anestesiar os ratos adultos de Sprague-Dawley com a mistura de cetamina/xilazina (43 mg/kg e 7 mg/kg, i.p.) e fixá-la na estrutura estereotáxica. Adicione anestesia com isoflurano (1,4% no ar; 1,2 mL/min) à injeção inicial de cetamina/xilazina, pois permite controlar a profundidade da anestesia no tempo. Raspe o pelo da cabeça do animal.
2. Limpe a superfície da pele da cabeça com solução à base de iodo seguida de etanol a 70% para prepará-la para cirurgia asséptica.
   1. Implante o dispositivo de cânula-eletrodo guia preparado em precedência (1.1 – 1.5) no hipocampo ventral direito usando as seguintes coordenadas: barra nasal + 5.0 mm, A – 3.4 mm, L + 4.5 mm, P + 6.5 mm para bregma. Siga as técnicas padrão para cirurgias estereotáxicas.
   2. Certifique-se de que não cobre os parafusos de ancoragem. Ao montá-lo no aparelho estereotáxico, segure o dispositivo pela cabeça da cânula guia, pois ela pode ser facilmente alinhada ao suporte da sonda.
3. Ancore o dispositivo ao crânio com pelo menos quatro parafusos de aço inoxidável aparafusando-os no osso do crânio (1 parafuso nas placas ósseas frontais esquerda e 1 parafuso nas placas ósseas frontais direitas, 1 parafuso nas placas ósseas parietais esquerdas e 1 parafuso nas placas ósseas interparietais). Adicione uma gota de cola de tecido para fixar ainda mais cada parafuso ao osso do crânio.
   1. Cubra metade das roscas dos parafusos com cimento metacrílico. Promova a ligação do cimento fazendo sulcos rasos no osso para aumentar a aderência.
4. Assim que a ponta do dispositivo estiver posicionada no tecido cerebral, torça o fio do eletrodo de aterramento em torno de 3 parafusos de ancoragem. Cubra todos os parafusos montados e o dispositivo com o cimento dentário.
5. Monitore os animais durante a cirurgia e por cerca de 1 h depois até ficarem em pé e se moverem ao redor da gaiola. Mantenha-os em uma almofada de aquecimento para evitar hipotermia. Permita que os ratos se recuperem por pelo menos 7 dias após a implantação do dispositivo.
6. Monitore os animais pelo menos uma vez ao dia durante 3 dias após a cirurgia para detectar sinais de dor ou angústia. Dê aos animais o creme antibiótico (gentamicina 0,1%) próximo ao local da incisão para prevenir a infecção e um analgésico (tramadol 5 mg/kg, intraperitoneal [i.p.]) por 3 dias para evitar a dor pós-cirúrgica.

3. Indução da Epilepsia do Lobo Temporal por Pilocarpina e Atribuição dos Animais aos Grupos Experimentais

1. Após uma semana de recuperação pós-cirúrgica, designar os animais aleatoriamente para os grupos: (i) animais controle recebendo veículo e (ii) animais epilépticos que receberão pilocarpina. Use um número proporcionalmente maior de animais para o grupo epiléptico, pois nem todos os ratos administrados com pilocarpina desenvolverão a doença.
2. Injete uma dose de metilescopolamina (1 mg/kg, subcutâneo [s.c.]) e 30 min depois, uma única injeção de pilocarpina (350 mg/kg, i.p.) para induzir o estado de mal epiléptico (SE). Injete metilescopolamina e o veículo (solução salina) nos ratos de controle. Use uma seringa de 1 mL com agulha 25G para todas as administrações intravenosas.
   1. Verifique visualmente os animais para começar a ter convulsões comportamentais (movendo a vibrissa dentro de 5 min, balançando a cabeça, clonando os membros) e dentro de 25 min para clonar continuamente todo o corpo (SE).
3. Pare o SE 2 h após o início para ter uma mortalidade de cerca de 25% e um período latente médio de aproximadamente 10 dias pela administração de diazepam (20 mg / kg, i.p.). Observe e registre qualquer comportamento convulsivo começando imediatamente após a injeção de pilocarpina e continue por pelo menos 6 h depois.
4. Dê aos animais solução salina (1 mL, i.p.) usando 1 mL de seringa com agulha 25G e solução de sacarose (1 mL, per os [p.o.]) usando 1 mL de seringa e agulha de alimentação flexível 17G por 2-3 dias após SE para promover a recuperação da perda de peso corporal.
   1. Excluir do estudo os animais que não atingirem o peso corporal inicial na primeira semana após a pilocarpina SE (exceto para o grupo agudo morto 24 h após SE, onde o acompanhamento do peso corporal não é possível).
5. Atribua animais pós-SE aleatoriamente a diferentes grupos experimentais (Figura 3): fase aguda (onde a microdiálise ocorre 24 horas após SE), latência (7-9 dias após SE), primeira convulsão espontânea (aproximadamente 11 dias após SE) e período crônico (começa cerca de 22-24 dias após SE, ou seja, cerca de 10 dias após a primeira convulsão). Monitore os animais quanto à ocorrência de convulsões espontâneas.
   NOTA: Use os seguintes critérios de inclusão / exclusão para experimentos adicionais em ratos epilépticos: desenvolvimento de SE convulsivo dentro de 1 h após a administração de pilocarpina; ganho de peso na primeira semana após o SE e o posicionamento correto da sonda de microdiálise e do eletrodo.

4. Monitoramento e Análise do Comportamento Epiléptico

1. Monitoramento de longo prazo do comportamento epiléptico
   1. Aproximadamente 6 h após a administração da pilocarpina (, ou seja, , ao final da observação direta pelos pesquisadores), coloque os animais nas gaiolas domésticas limpas e inicie o monitoramento por vídeo 24 horas.
   2. Continue a videomonitorização 24 h até ao dia 5, utilizando um sistema de videovigilância digital.
   3. A partir do dia 5, conecte os ratos em suas gaiolas retangulares domésticas ao sistema de gravação de EEG amarrado e continue o monitoramento de vídeo 24 horas.
   4. Defina os parâmetros no amplificador posicionado fora da gaiola de Faraday (defina o fator de amplificação em cada canal de acordo com a especificidade do sinal de EEG de cada animal) e inicie a aquisição de EEG observando o sinal de EEG produzido por cabos desconectados. Use a taxa de amostragem de 200 Hz e o filtro passa-baixo definido para 0,5 Hz.
   5. Conecte o animal a cabos que seguram a cabeça de um animal entre dois dedos esticados de uma mão e aparafusando os conectores ao pedestal do eletrodo usando a outra mão livre. Inicie a aquisição.
      CUIDADO: Certifique-se de que o sinal esteja livre de artefatos. Artefatos comuns são os picos que excedem em muito a escala.
   6. Um dia antes do experimento de microdiálise, transfira os animais para o sistema de EEG amarrado equipado com cilindros de plexiglass para microdiálise. Desconecte os animais do sistema de amarração EEG na gaiola doméstica, aparafusando os conectores do eletrodo sem conter o animal. Coloque o animal nos cilindros altos de plexiglass.
2. Monitoramento do comportamento epiléptico um dia antes e durante a sessão de microdiálise
   1. Ligue o amplificador posicionado fora da gaiola de Faraday. Abra o software EEG. Inicie a aquisição do EEG observando o sinal de EEG produzido por cabos desconectados.
   2. Conecte o animal ao sistema de gravação de EEG amarrado, segurando a cabeça de um animal entre dois dedos esticados de uma mão e aparafusando os conectores ao pedestal do eletrodo usando a outra mão livre. Defina um fator de amplificação (ganho) em cada canal do amplificador de acordo com o sinal do eletrodo de um único animal para que o sinal de EEG esteja em escala. Deixe o animal explorar a nova gaiola (cilindro) por pelo menos 1 h sob a observação direta do pesquisador.
   3. NOTA: 24 h antes do experimento de microdiálise, os ratos são brevemente anestesiados com isoflurano para a troca das cânulas guia pela sonda de microdiálise. Aproveite o momento em que eles são anestesiados para conectá-los ao sistema de registro de EEG.
   4. Encurte ou prolongue o cabo pendente de acordo com a mercadoria do animal. Certifique-se de que os cabos não interfiram nos movimentos do animal e na postura deitada.
   5. Verifique o enquadramento correto da imagem das câmeras de vídeo. Inicie a gravação do vídeo-EEG.
3. Identificação de convulsões e atividade de EEG
   1. Use um reprodutor de software para assistir aos vídeos. Role o filme 8 vezes mais rápido do que a reprodução em tempo real e individe as convulsões generalizadas (veja animal para criar com clônus de membro anterior ou criação de animal e queda com clônus de membro anterior). Diminua a velocidade do vídeo e anote a hora exata do início e do fim da convulsão comportamental.
   2. Processe os dados contando o número de convulsões generalizadas observadas em 24 h de registros de vídeo e expresse-os em termos de frequência e duração das convulsões como valores médios de todas as convulsões observadas em 24 h.
   3. Defina as convulsões de EEG como os períodos de atividade paroxística de alta frequência (>5 Hz) caracterizados por um incremento de amplitude de >3 vezes em relação à linha de base com progressão da frequência de pico que dura para um mínimo de 3 s ou similar. Use o software de EEG para processar as gravações brutas de EEG. Divida os traços de EEG em frações de 1 h. Copie as frações de rastreamento de EEG para file para análise automática de pico de software.
   4. Analise os dados da atividade do EEG usando o software EEG e parâmetros predefinidos (4.3.3.). Realize todas as análises de vídeo em dois investigadores independentes que são cegos para o grupo de animais analisados. Em caso de divergência, faça-os reexaminar os dados juntos para chegar a um consenso.

5. Microdiálise

1. Recuperação da sonda in vitro
   1. Prepare a sonda para seu primeiro uso de acordo com as instruções do fabricante, manuseando-a em sua capa protetora.
   2. Executar o experimento em triplicata: preparar três tubos de ensaio de 1,5 mL carregando-os com 1 mL de solução de Ringer contendo a mistura de padrões (2,5 μM de glutamato e 2,5 μM de aspartato). Coloque três tubos de ensaio carregados de 1.5 mL no aquecedor de bloco ajustado para 37 °C e posicione-o no agitador.
      NOTA: Use as mesmas soluções padrão para calibrações de cromatografia.
   3. Sele os tubos de ensaio de 1,5 mL com filme de parafina e perfure-os com uma pinça afiada para fazer um orifício de cerca de 1 mm de diâmetro.
   4. Pegue a sonda e insira-a no orifício feito em filme de parafina. Mergulhe a membrana pelo menos 2 mm abaixo do nível da solução. Fixe ainda mais a sonda em tubo de ensaio de 1,5 mL com filme de parafina.
      CUIDADO: Certifique-se de que a ponta não toque nas paredes do tubo de ensaio de 1,5 mL.
   5. Conecte a entrada da sonda à seringa montada na bomba de infusão usando etileno propileno fluorado (FEP) - tubos e adaptadores de tubos. Opcionalmente, use tubos de polietileno de diâmetro fino de 0,28 mm de diâmetro interno (ID) e 0,61 mm de diâmetro externo (OD) e adaptadores de tubos coloridos (adaptadores de tubos vermelhos e azuis) para conexões.
   6. Ligue a bomba a 2 μL/min e deixe o fluido aparecer na ponta de saída. Conecte a saída da sonda ao tubo de ensaio coletor de 0.2 mL usando tubos FEP e adaptadores de tubos.
      NOTA: Use tubulação FEP para todas as conexões. Corte o comprimento desejado do tubo usando uma lâmina de barbear. Use adaptadores de tubos de cores diferentes para entrada e saída da sonda. Deixe a bomba funcionar por 60 min. Verifique se há vazamentos e bolhas de ar. Estes não devem estar presentes.
   7. Ajuste a bomba para a vazão de 2 μL/min e comece a coletar as amostras no lado de saída da tubulação.
   8. Colete três amostras de perfusato de 30 min e três amostras de volume igual da solução no tubo de ensaio de 1,5 mL. Retire as amostras de volume igual do tubo de ensaio de 1,5 mL a cada 30 minutos usando a microsseringa imersa na solução padrão no tubo de ensaio de 1,5 mL.
   9. Repetir a experiência (5.1.1-5.1.8) regulando a bomba para um caudal de 3 μl/min (5.1.7) para obter uma comparação da recuperação da sonda quando se utilizarem dois caudais de perfusão diferentes.
   10. Quando terminar, pare a bomba e enxágue a tubulação com água destilada, etanol 70% e empurre o ar para dentro dela. Armazene a sonda em um frasco cheio de água destilada limpa. Enxágue bem a sonda perfundindo-a a 2 μL / min com água destilada antes do armazenamento.
   11. Analisar a concentração de glutamato e aspartato nas amostras por cromatografia.
   12. Calcule a recuperação usando a seguinte equação:
       Recuperação (%) = (C_perfusato /C_{solução dialisada}) x 100.
2. Sessões de microdiálise em ratos em movimento livre
   1. Procedimentos preparativos: inserção e teste da sonda, configuração e início da bomba de infusão
      1. Prepare as sondas de microdiálise para o primeiro uso de acordo com o guia do usuário do fabricante e encha-as com a solução de Ringer. Corte pedaços de tubos FEP com cerca de 10 cm de comprimento e conecte-os às cânulas de entrada e saída da sonda usando os adaptadores de tubos de cores diferentes.
      2. Certifique-se de que a tubulação toque os adaptadores sem espaço morto em todas as conexões.
      3. 24 h antes do experimento de microdiálise, anestesiar brevemente o animal com isoflurano (5% no ar) em uma câmara de indução até ficar deitado. Remova a cânula fictícia de sua guia usando a pinça e segurando a cabeça do animal com firmeza. Insira a sonda de microdiálise, dotada de uma membrana de diálise, na cânula guia e firme ainda mais as cânulas de microdiálise inseridas em sua guia por meio de massa de modelar.
         CUIDADO: Não deixe a sonda tocar nas paredes da manga protetora da sonda ao extrair.
      4. Coloque o animal no cilindro de acrílico e deixe-o explorar o novo ambiente. Ligar o animal ao sistema de registo de EEG cativo conforme descrito acima (seguir os pontos 4.2.2 e 4.2.3).
      5. Siga os movimentos do rato acordado e em movimento livre e conecte a entrada da sonda à seringa de 2.5 mL com agulha 22G embotada contendo a solução de Ringer usando os adaptadores de tubo. Empurre a solução de Ringer dentro da sonda ejetando 1 mL da solução de Ringer em 10 s, empurrando continuamente o pistão da seringa de 2,5 mL. Verifique se há gota do líquido aparecendo na saída. A sonda agora está pronta para uso.
      6. Encha as seringas de 2,5 mL conectadas ao tubo FEP por adaptadores de tubo com a solução de Ringer e monte-as na bomba de infusão. Ligue a bomba a 2 μL/min. Deixe funcionar durante a noite.
         NOTA: Use o comprimento desejado de todos os tubos FEP, mas calcule o volume morto do tubo para saber quando a estimulação K ⁺ deve ser iniciada e para correlacionar os dados de quantificação com alterações neuroquímicas no cérebro animal. Use a bolha de ar criada na tubulação sob o fluxo de trabalho para calcular esse tempo.
   2. Coleta de amostras durante o registro de EEG e estimulação de potássio
      1. Verificar a ausência de convulsões nas 3 h anteriores ao início da coleta de amostras (gravações de vídeo-EEG) e continuar monitorando a atividade convulsiva durante a microdiálise.
      2. Pare a bomba que transporta as seringas canuladas com tubo FEP cheias com solução de Ringer. Monte na bomba outro conjunto de seringas de 2,5 mL conectadas ao tubo FEP com adaptadores de tubo preenchidos com uma solução de Ringer modificada contendo 100 mM de solução de K⁺.
      3. Ligue a bomba a 2 μL/min e deixe-a funcionar. Para um enchimento mais rápido da tubulação, ajuste a bomba em 5 μL/min para o tempo de enchimento. Verifique a ausência de bolhas de ar no sistema. Certifique-se de que a tubulação toque nos adaptadores sem espaço morto em todas as conexões.
      4. Testar a sonda se estiver pronta para ser utilizada em animais, conforme descrito acima (5.2.1.5).
      5. NOTA: Se por algum motivo a sonda não funcionar, troque-a. Para esses casos, mantenha algumas sondas de microdiálise preparadas prontas para uso perto da estação de trabalho de microdiálise-EEG. Desconecte o animal dos cabos de EEG e anestesieste-o brevemente com isoflurano, se necessário, para realizar a mudança.
      6. Conecte o tubo FEP de seringas cheias com solução de Ringer à cânula de entrada da sonda em cada animal e aguarde o aparecimento da gota de líquido na ponta da saída.
      7. Conecte a saída da sonda ao tubo FEP, o que leva à coleta no tubo de ensaio. Insira o tubo FEP no tubo de ensaio fechado de 0.2 mL com uma tampa perfurada. Certifique-se de que o tubo permaneça no lugar fixando com um pedaço de massa de modelar.
      8. Continue a operar a bomba a 2 μL/min por 60 min sem coletar amostras para equilibrar o sistema (amostra zero).
      9. Colete 5 amostras consecutivas de dialisato de 30 min (60 μL de volume respectivo) em condições basais (perfusão com solução de Ringer normal). Armazene amostras no gelo.
      10. Calcule o tempo que o líquido leva para passar da bomba para a cabeça do animal (depende do volume morto do tubo, ou seja, tempo de bolha de ar) e mude o tubo FEP que vai das seringas contendo solução de Ringer normal para seringas contendo solução de Ringer modificada (100 mM K⁺) neste momento sem parar a bomba. Verifique a ausência de bolhas de ar no sistema. Deixe a bomba funcionar por 10 min. CUIDADO: Em 10 min de alta estimulação K⁺, os animais tendem a se mover freneticamente e geralmente apresentam um grande número de tremores de cachorro molhados (animais de controle e fora de convulsão) ou convulsões comportamentais (animais epilépticos), portanto, esteja pronto para intervir para proteger a tubulação e os cabos de torcer.
      11. Após 10 min, troque o tubo das seringas contendo 100 mM de solução de Ringer K⁺ para a solução de Ringer normal e deixe a bomba funcionar. Não desligue a bomba durante as trocas de solução para que haja uma gota do líquido na extremidade da tubulação a ser conectada em linha.
      12. A partir do momento em que o dialisato contém alto teor de potássio, ou seja, após a coleta do quinto dialisado pós-equilíbrio, coletar as frações do dialisato a cada 10 min (20 μL) por 1 h. Colete 3 amostras adicionais de dialisado de 30 minutos e pare a bomba. Armazene as amostras no gelo.
      13. Armazenar as amostras a -80 °C após o experimento até a análise por cromatografia líquida de alta resolução (HPLC).
      14. Repita o experimento de microdiálise por 3 dias consecutivos, exceto para o grupo agudo (24 h) e a primeira convulsão, em que apenas uma sessão de microdiálise ocorre 24 h após o SE ou dentro de 24 h após a primeira convulsão espontânea (Figura 3).

Resultados

Figura 1. Preparação passo a passo do dispositivo a ser implantado. (A) Eletrodo de 3 canais com eletrodo de aterramento de 10 cm de comprimento em sua manga protetora à esquerda e cânula guia para microdiálise à direita necessária para montar o disp...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
3-channel two-twisted	Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA	MS333/3-B/SPC	Material
guia	Agn Tho's, Lindigö, Suécia	MAB 4.15.IC	Material
Resina KK2 Plastik	Elettra Sport, Lecco, Itália	KK2	Material
Super Attack gel Loctite	Henkel Italia Srl, Milano, Itália	2047420_71941	Material
Imalgene-Ketamine	Merial, Toulouse, França	221300288 Solução (AIC)	Solução
Xylazine	Sigma, Milano, Italy	X1251	Material
Isoflurane-Vet	Merial, Toulouse, França	103120022 (AIC)	Solution
Altadol 50 mg/ml - tramadol	Formevet, Milano, Itália	103703017 (AIC)	Solution
Gentalyn 0.1% crm - gentamicina	MSD Italia, Roma, Itália	20891077 (AIC)	Material
simplex rapid dental	Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, Reino Unido	ACR811	Material
GlasIonomer CX-Plus Cement	Shofu, Kyoto, Japão	PN1167	Material
suporte de clipe de sonda	Agn Tho's, Lindigö, Suécia	p/n 100 5001	Equipamento
Histoacryl® Blue Topical Skin Adhesive	TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, EUA	TS1050044FP	Material
Valium 10 mg/2 ml - diazepam	Roche, Monza, Itália	019995063 (AIC)	Material
1 seringa de 1 mL com agulha 25G	Vetrotecnica, Padova, Itália	3	Material
agulha de alimentação flexível para ratos 17G	Agn Tho's, Lindigö Suécia	7206	Material
Grass Technology apparatus	Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, Califórnia, EUA	M665G08	Equipamento (amplificador AS40, caixa de cabeça, cabos de interconexão, telefator modelo RPSA S40)
sistema modular de aquisição e análise de dados MP150	Biopac, Goleta, Califórnia, EUA	MP150WSW	Equipment
sistema de vigilância por vídeo digital	AverMedia Technologies, Fremont, Califórnia, EUA	V4.7.0041FD	Equipment
sonda de microdiálise	Agn Tho's, Lindigö Suécia	MAB 4.15.1.Cu	Material
sonda de microdiálise	Synaptech, Colorado Springs, Colorado, EUA	S-8010	Material
block heater	Grant Instruments, Cambridge, Inglaterra	QBD2	Equipment
stirrer	Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italy	711	Equipment
bomba de infusão	Univentor, Zejtun, Malta	864	Equipment
tubo de polietileno de furo fino	Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, EUA	800/100/100/100	Material
adaptadores de tubos azuis	Agn Tho's, Lindigö Suécia	1002	Material
adaptadores de tubos vermelhos	Agn Tho's, Lindigö Suécia	1003	Material
Seringa de 2,5 mL com agulha 22G	Chemil, Pádua, Itália	S02G22	Material
tampa do frasco	Cronus, Labicom, Olomouc, República Tcheca	VCA-1004TB-100	Material
septum	Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USA	National C4013-60 8 mm TEF/SIL septum	Material
inserção de vidro com mola inferior	Supelco, Sigma, Milano, Itália	27400-U	Material
frasco de amostrador automático	National Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, Itália	C4013-2	Material
Smartline manager 5000 controlador de sistema e unidade de desgaseificação	Knauer, Berlim, Alemanha	V7602	Equipamento
Smartline 1000 bomba de gradiente quaternário	Knauer, Berlim, Alemanha	V7603	Equipamento
Composição da solução de Ringer	em mM: MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, 0.3% BSA		Solution
modified Composição da solução de Ringer	em mM: MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0.3% BSA		Solution
salina	0.9% NaCl, ph ajustado para 7.0		Solução
solução de sacarose	10% de sacarose em solução de água		Solução

electrode cement destilada