Imunomarcação de proteínas da membrana neuronal em uma amostra fraturada por congelamento de tecido cerebral de camundongo

Resumo

Fonte: Schönherr, S., et. al. Imunomarcação Combinada de Réplica Optogenética e de Fratura por Congelamento para Examinar o Arranjo Específico de Entrada de Receptores de Glutamato na Amígdala de Camundongo. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra a imunomarcação de réplicas fraturadas por congelamento de tecido cerebral de camundongo para microscopia eletrônica. As réplicas fraturadas e revestidas são digeridas para expor os receptores. Anticorpos primários e secundários marcados com ouro são adicionados para rotular receptores específicos da membrana neuronal. A réplica é montada em uma grade e visualizada sob um microscópio eletrônico.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Preparação de amostras

1. Fixação cerebral
   1. Preparação do fixador
      1. Para 1 L de fixador, pesar 10 g de paraformaldeído e adicioná-lo a 300 ml de água deionizada (H₂O). Aqueça a 55 - 60 ºC por ~ 10 min com agitação contínua.
      2. Desligue o fogo e adicione 7 a 8 gotas de hidróxido de sódio (NaOH) 4 N. A solução deve ficar clara em ~ 10 minutos.
      3. Deixar arrefecer até à temperatura ambiente ou RT, adicionar 150 ml de uma solução saturada de ácido pícrico e levar a 500 ml com H₂O deionizado.
      4. Adicionar 500 ml de tampão fosfato 0,2 M (PB). Filtre com papel de filtro. Ajuste o pH para 7,4 com NaOH.
      5. Arrefecer o fixador a 6 ºC e conservá-lo em frascos de vidro escuro durante um período não superior a um dia a 6 ºC.
   2. Perfusão transcardíaca
      1. Anestesiar camundongos com uma injeção intraperitoneal de tiopental (120 mg/kg de peso corporal). Certifique-se de que o animal esteja profundamente anestesiado, verificando o reflexo de retirada do pedal, que deve estar ausente. Coloque o animal de costas em uma mesa de perfusão com as quatro extremidades amarradas.
      2. Abra a parede abdominal longitudinalmente com uma tesoura de ponta romba e faça dois cortes adicionais lateralmente ao longo da borda caudal da caixa torácica para expor o diafragma. Corte o diafragma e corte a parede torácica na borda osteocartilagenea em ambos os lados. Levante a extremidade caudal da placa central da parede torácica que contém o esterno para expor o coração.
      3. Remova o pericárdio e faça um corte pequeno e preciso na ponta do ventrículo esquerdo para admitir a cânula do aparelho de perfusão. Use uma cânula romba com diâmetro interno de 0,6 mm. Passe a cânula suavemente pelo ventrículo até que a ponta apareça na aorta ascendente e prenda a cânula com uma pinça. Para permitir que o sangue e os perfusados saiam da corrente sanguínea, faça um corte no átrio direito.
      4. Perfundir camundongos por via transcárdica usando uma bomba peristáltica a uma taxa de fluxo de 5 ml / min inicialmente com solução salina tampão fosfato ou PBS (25 mM, cloreto de sódio a 0,9% ou NaCl, pH 7,4) por aproximadamente 1 min, seguido de fixador gelado por 7 min.
      5. Após a fixação, corte a cabeça do rato com uma tesoura e corte a pele na linha média do pescoço ao nariz. Remova o músculo para expor totalmente o crânio.
      6. Usando uma tesoura afiada, faça um corte longitudinal nos ossos occipital e interparietal a partir do forame magno. Usando uma pinça fina, remova esses ossos para expor todo o cerebelo. Em seguida, faça outro corte longitudinal através dos ossos parietal e frontal até o osso nasal e remova-os com uma pinça para expor todo o cérebro.
      7. Usando uma espátula, remova o cérebro sem danificá-lo e coloque-o em 0,1 M PB gelado.
2. Corte e corte dos espécimes
   1. Corte um bloco coronal de aproximadamente 5 - 6 mm com lâminas de barbear contendo a área de interesse. Cole-o no suporte do vibroslicer com uma cola de cianoacrilato. Oriente o bloco de tecido de forma que o neocórtex fique voltado para a lâmina vibratória. Corte cortes coronais contendo a amígdala a 140 μm com o vibroslicer (Figura 1A) em PB 0,1 M gelado e colete-os em um prato de 6 poços no mesmo tampão.
   2. Sob um estereomicroscópio, corte a região de interesse (aqui, o aglomerado paracapsular medio-dorsal das massas celulares intercaladas da amígdala ou ITC; veja a Figura 1B) da fatia. Faça isso em uma placa de Petri revestida com elastômero de silicone e preenchida com 0,1 M PB, usando um bisturi oftálmico. Certifique-se de que os blocos aparados encaixam no orifício do espaçador (aproximadamente 1.5 mm) (Figura 1B).
   3. Mova os blocos aparados para a solução de crioproteção (glicerol a 30% em 0,1 M PB) durante a noite (O/N) a 6 ºC.

2. Congelamento de alta pressão

NOTA: A Imunomarcação de Réplica de Fratura por Congelamento (FRIL) consiste em 6 etapas essenciais (Figura 2): 1) Congelamento rápido com alta pressão (a 2.300 - 2.600 bar) da amostra. 2) Fratura da amostra. O plano de fratura geralmente segue o núcleo hidrofóbico central das membranas congeladas, dividindo-as em dois folhetos de meia membrana: uma metade que fica adjacente ao protoplasma (face P) e uma metade que fica adjacente ao espaço extracelular ou exoplasmático (face E). 3) Replicação do espécime por deposição a vácuo de platina e carbono. 4) Digestão detergente do tecido. 5) Marcação de Immunogold. 6) Análise da réplica usando um microscópio eletrônico de transmissão.

1. Preparação de transportadores de cobre
   NOTA: Para serem manuseados através das etapas sucessivas do procedimento FRIL, as amostras precisam ser montadas em suportes de metal (ouro ou cobre). Esses transportadores variam em tamanho e design de acordo com o modo de fraturamento e o tipo de máquinas usadas. Aqui, usamos suportes de cobre (Figura 1B, E) e uma "mesa de réplica dupla" articulada (ver Figura 3B), que, quando aberta, produz uma fratura por tração através do corpo de prova congelado (Figura 2). Isso permite reter e replicar ambos os lados da amostra fraturada.
   1. Polish copper carriers with a tarnish remover using a towel of chamois skin.
   2. Coloque os transportadores em uma panela de vidro e limpe duas vezes com um detergente não iônico (pH ~ 1,5) em banho-maria sônico, depois lave extensivamente em água da torneira seguida de água deionizada e depois enxágue duas vezes com etanol.
   3. Sonicar os transportadores de cobre em acetona durante 15 min.
   4. Coloque os suportes em papel de filtro para secar.
   5. Prenda um anel de fita dupla-face a um suporte de cobre (Figura 1C), que servirá como poço de retenção para o bloco aparado (suporte de suporte).
2. Congelamento da amostra
   NOTA: Manuseie o nitrogênio líquido com cuidado e usando óculos apropriados.
   1. Ligue a unidade de congelamento de alta pressão (Figura 1F) por pelo menos 1.5 horas antes de congelar a amostra.
   2. Comece a aquecer pressionando o botão "AQUECEDOR DE AR" e leve ao forno por 50 min. Defina a temperatura do ar para 80 °C.
   3. Conecte o tanque de nitrogênio à unidade de congelamento de alta pressão e pressione o botão "NITROGÊNIO" para encher o Dewar interno com nitrogênio líquido. A lâmpada "NITROGÊNIO NÍVEL" acende. Comece a resfriar pressionando o botão "Resfriamento".
   4. Pressione o botão "DRIVE IN" quando o "NITROGEN LEVEL" se apagar. Verifique se o sistema hidráulico move o pistão para frente e para trás 3 vezes.
   5. Pressione o botão "AUTO" e o botão "NITROGÊNIO". Assim que "READY" acender, a unidade de congelamento de alta pressão estará pronta para o congelamento de alta pressão.
   6. Coloque um bloco aparado no orifício da fita dupla face (Figura 1B) usando um laço de fio de platina que foi derretido em uma pipeta de vidro.
   7. Remova o excesso da solução crioprotetora usando papel de filtro ou pincel.
      NOTA: Este procedimento também é importante para remover bolhas de ar que podem se formar ao redor do tecido e que podem causar distorção da forma e/ou ultraestrutura do tecido.
   8. Sob um estereomicroscópio, cubra o suporte de retenção com outro suporte, de modo que o bloco de tecido fique imprensado entre os dois suportes.
   9. Insira o sanduíche transportador no suporte de amostra da unidade de congelamento de alta pressão (Figura 1D). Insira o porta-amostras na unidade de congelamento de alta pressão (com a ponta para baixo) e prenda-o aparafusando o porta-amostras.
   10. Inicie o ciclo de congelamento pressionando o botão "Jet-Auto". Trabalhando o mais rápido possível, remova o suporte da amostra e mergulhe a ponta com nitrogênio líquido em uma caixa isolada. Mergulhe as pontas de dois pares de pinças no nitrogênio líquido para resfriá-las.
   11. Remova cuidadosamente o sanduíche transportador do suporte da amostra e coloque-o em um criotubo pré-resfriado. Certifique-se de que os transportadores sejam manuseados apenas com pinças resfriadas por nitrogênio líquido. Os criogenianos devem ser perfurados para permitir que o nitrogênio flua para fora do frasco ( Figura 1G ).
   12. Repita as etapas 2.2.6 a 2.2.11 até que todas as amostras desejadas tenham sido congeladas. Vários sanduíches transportadores contendo o mesmo tipo de amostra podem ser armazenados no mesmo frasco.
   13. Armazene os criotubos contendo os transportadores em um tanque criogênico até a replicação (Figura 1H).

3. Fratura por congelamento e replicação

1. Preparação dos canhões de feixe de elétrons
   1. Antes de inserir os canhões de feixe de elétrons, remova a blindagem com a "placa defletora". Coloque o "medidor de ajuste" para centralizar o filamento no mandril da pinça através da tampa do cátodo inferior.
      NOTA: A extremidade de diâmetro maior do medidor de ajuste é usada para a pistola de carbono, enquanto a extremidade de diâmetro menor é para a pistola de platina.
   2. Deslize o novo filamento sobre o medidor até que "as lâminas de pressão" possam prender as extremidades do filamento, garantindo que a bobina do filamento não fique em ângulo.
   3. Remova o medidor de configuração e insira a haste de carbono. Fixe-o apertando o mandril da pinça do suporte da haste do evaporador, certificando-se de que a altura da extremidade da haste esteja no meio da segunda bobina a partir da parte inferior. Para a pistola de platina, a altura da extremidade da haste de platina deve estar no meio da segunda bobina de filamento a partir do topo.
   4. Recoloque a placa defletora e insira as pistolas na unidade de fratura por congelamento. Limpe as pistolas com um jato de areia após o uso.
2. Configuração da unidade de fratura por congelamento
   1. Ligue a unidade de fratura por congelamento (Figura 3A) girando MAINS para 1. Para uma descrição pormenorizada dos procedimentos de fractura por congelação e de replicação, consulte o manual de instruções fornecido pelo fabricante.
   2. Antes de resfriar o dispositivo de fratura por congelamento, asse todo o sistema de resfriamento da unidade com ar quente. Pressione o botão "Descongelamento" no dispositivo MTC 010 (unidade de controle de temperatura) (Figura 3A) e deixe o processo de cozimento funcionar por 45 min.
   3. Ative a estação de vácuo. A unidade de fratura por congelamento geralmente opera em uma faixa de vácuo de ~^10-6 - ^10-7 mbar.
   4. Encha o tanque de nitrogênio e conecte-o à unidade de fratura por congelamento. Verifique se o porta-válvulas está seco e limpe também a entrada do reservatório antes de inseri-lo (a umidade pode interferir no vácuo e na indicação do enchimento de N₂ do reservatório).
   5. Comece a resfriar ajustando a temperatura para -115 °C. O resfriamento leva cerca de 45 min.
   6. Insira os canhões de feixe de elétrons e ajuste a corrente e a tensão para atingir os seguintes parâmetros de evaporação:
      Pistola de carbono: rotação ligada, posição 90°, taxa de acúmulo de carbono 0,1 - 0,2 nm/seg
      Pistola de carbono-platina: rotação desligada, posição 60°, taxa de acúmulo 0,06 - 0,1 nm/seg
      NOTA: Se uma pistola for usada pela primeira vez após a troca da haste de carbono ou platina, Desgaseifique por 3 min antes do uso.

3. Fraturamento e replicação

   1. Insira sanduíches congelados em uma tabela de réplica dupla, certificando-se de que todas as manipulações sejam feitas em nitrogênio líquido.
   2. Transfira a mesa de réplica dupla para um vaso Dewar e fixe-a no receptor do estágio de amostra em um ângulo de 45°. O nível de nitrogênio líquido deve estar sempre acima da tabela de réplica dupla.
   3. Pegue a mesa de réplica dupla com o manipulador de mesa e insira-a na unidade de fratura por congelamento no estágio frio. Aguarde aproximadamente 20 min para permitir que a temperatura da mesa de réplica dupla se ajuste para -115 °C.
   4. Verifique se o vácuo está abaixo ^{de 10-6} mbar e se a temperatura é de -115 °C.
   5. Fraturar o tecido por rotação manual no sentido anti-horário da roda conectada à cobertura colocada acima da mesa de réplica dupla. Quando a mortalha gira, ela força a abertura da mesa de réplica dupla, fraturando o tecido.
   6. Pressione o botão "Alta tensão" no dispositivo EVM 030 (unidade de controle de evaporação por feixe de elétrons) da unidade de fratura por congelamento (Figura 3A).
   7. Replicar as superfícies expostas do tecido fraturado (Figura 3C) por evaporação do carbono (rotação) por meio de um canhão de feixe de elétrons posicionado em um ângulo de 90° com uma espessura de 5 nm, seguido por um sombreamento unidirecional com carbono-platina em um ângulo de 60° com uma espessura de 2 nm. Por fim, aplique uma camada de carbono de 15 nm de espessura em um ângulo de 90° (girando).
   8. Use os seguintes parâmetros para evaporação:
      1º carbono: rotação ligada, posição 90°; velocidade 0,1 - 0,2 nm/seg; 5 nm
      2º carbono-platina: posição 60°; velocidade 0,06 - 0,1 nm/seg; 2 nm
      3º carbono: rotação ligada, posição 90°; velocidade 0,3 - 0,5 nm/seg; 15 nm
   9. Remova os espécimes replicados da unidade de fratura por congelamento e transfira-os para uma placa cerâmica de 12 poços (Figura 4A) preenchida com TBS ( Solução salina tamponada com Tris, pH 7,4).
   10. Usando um fio-máquina de laço de platina, remova o tecido replicado do transportador de amostras (Figura 4A).
   11. Repita as etapas 3.3.1 a 3.3.10 até que todos os exemplos tenham sido replicados.

   4. Digestão SDS da réplica

   1. Transfira a réplica para um frasco de vidro de 4 ml cheio de 1 ml de tampão de digestão SDS (2,5% de Lauril Sulfato de Sódio, 20% de sacarose em 15 mM Tris, pH 8,3). Digerir durante 18 horas a 80 °C com agitação (45 golpes/min).
   2. Transferir as réplicas para um novo tubo cheio de tampão de digestão SDS e conservá-las à temperatura de saída.

4. Imunomarcação

NOTA: Todas as incubações são realizadas em RT com agitação suave, exceto para incubações com anticorpos.

1. Lave a réplica por 10 min em tampão de digestão de dodecil sulfato de sódio fresco (SDS).
2. Lave a réplica uma vez com 2,5% de BSA (albumina de soro bovino) em solução salina Tris-Buffered ou TBS por 5 min e, em seguida, 3 x 10 min com 0,1% de BSA em TBS.
3. Bloqueie locais de ligação não específicos em TBS com 5% de BSA por 1 hora.
4. Aplique anticorpos primários diluídos em 2% de BSA-TBS. Realizar incubações em gota de 30 μl (Figura 4B) numa câmara húmida a 15 °C durante 72 horas (Figura 4C).
   1. Para este estudo, processe ambas as réplicas do tecido fraturado. Incubar uma réplica com um anticorpo policlonal de cobaia criado contra os aminoácidos 717 - 754 do GluR1 de camundongo comum a todas as subunidades do receptor de ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropiônico ou AMPA-R (diluição: 1:200) ou um anticorpo monoclonal de camundongo criado contra uma proteína de fusão recombinante cobrindo os aminoácidos 660 - 811 da subunidade NR1 do receptor N-metil-D-aspartato ou NMDA-R (diluição: 1:500) e um anticorpo policlonal de coelho criado contra a proteína fluorescente verde (diluição: 1:300).
   2. Incubar a outra réplica com um anticorpo policlonal de coelho criado contra um peptídeo sintético correspondente aos aminoácidos 384 - 398 do receptor μ-opióide de rato (diluição: 1:500).
5. Lavar em TBS com 0,05% de BSA (3 x 5 min.).
6. Aplique anticorpos secundários. Para este estudo, use anticorpos conjugados com ouro (5 nm para receptores ionotrópicos de glutamato, 10 para receptores μ-opioides e/ou 15 nm para Channelrhodopsin-2 Yellow Fluorescent Protein ou ChR2-YFP) anticorpos conjugados diluídos em TBS com 2% de BSA. Diluir os anticorpos secundários a 1:30 e incubar numa gota de 30 μl a 15 °C O/N.
7. Lave 3 x 5 min em 0,05% BSA-TBS em RT.
8. Lave 2 x 5 min em água ultrapura.
9. Monte a réplica na grade de barra paralela de 100 linhas revestida com formvar (Figura 4D).

Resultados

Figura 1. Preparação de tecidos e congelamento de alta pressão. (A) O Vibroslicer é usado para seccionar o tecido. (B) Uma seção coronal do cérebro de camundongo resultante contendo a amígdala é mostrada la...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tissue preparation
Paraformaldeído EM grade	Agar Scientific Ltd., Reino Unido	AGR1018
Solução saturada de ácido pícrico	Sigma-Aldrich, EUA	P6744-1GA
Na2HPO4-2H20	Merck Millipore, Alemanha	1065860500
NaH2PO4-2H2O	Merck Millipore, Alemanha	1063451000
NaCl	Merck Millipore, Alemanha	1064041000
4N NaOH	Carl Roth, Alemanha	T198.1
Thiopental	Sandoz, Áustria<
Glycerol	Sigma-Aldrich, USA	G5516-500ML
GenPure ultrapure water system	Thermo Fisher Scientific, USA	50131235
Bomba peristáltica	ISMATEC, Alemanha	ISM 930C
Filter Paper	MACHEREY-NAGEL, Alemanha	MN 615 1/4
Vibroslicer, VT1000S	Leica Microsystems, Áustria<
Ophthalmic scalpel	Alcon Laboratories, EUA
Cânula de perfusão	Vieweg, Alemanha	F560088-1
Congelamento
Coppercarriers	Engineering Office M. Wohlwend, CH	528
Sidol Polonês	Henkel, Alemanha
Chamois skin	Loja de artigos domésticos
Holepunch, 1,5mm	Stubai, Áustria<
Denatured ethanol	Donauchem, Áustria<
Acetona	Roth, Alemanha	9372.5
Máquina de congelamento de alta pressão HPM 010	BalTec, CH; agora Leica Microsystems	HPM010
Stereo-microscope<
Liquid nitrogen
Cryo-vials	Roth, Germany<
CryoCane	Nalge Nunc International,USA	5015-0001
CryoSleeve	Nalge Nunc International,USA	5016-0001
Recipiente de armazenamento de nitrogênio líquido	Cryopal, França	GT38
Non-ionic detergent (Lavocid)<
Freeze-fracture and Replication
Sandblaster, Mikromat 200-1	JOKE Joisten & Kettenbaum, Alemanha<
siliciumcarbid SIC 360, tamanho do grão 25 - 21μ
Sistema de fratura por congelamento BAF 060	BalTec, CH; agora Leica Microsystems	BAF060
Placa cerâmica de 12 poços	Gröpel, Áustria	14511
Trizma base	SIGMA, USA	T1503
Trizma hydrochloride	SIGMA, USA	T3253
Sodium chloride	Merck, Alemanha	1,06,,06,40,41,000
SDS, lauril sulfato de sódio	Roth, Alemanha	5136.1
Sacarose	Merck, Alemanha	1,07,68,71,000
TRIS	Roth, Alemanha	5429.3
Universal Hybridization Oven	Binder, Germany<
Immunolabelling
BSA	SIGMA, USA	A9647
Anticorpo anti-GFP	Molecular Probes, USA	A11122
Anti-pan-AMPAR Antibody	Frontier Institute, Japão<
Anti-NMDAR1 Antibody, clone 54.1	Merck Millipore, Alemanha	MAB363
Opioid Receptor-Mu (MOR) Antibody	ImmunoStar, USA	24216
EM cabra anti-cobaia, 5nm; anticorpo secundário	BBInternational,	EM. GAG5
EM cabra anti-coelho, 15nm; anticorpo secundário	BBInternational,	EM. GAR15
Donkey anti-rabbit, 10nm, secondary antibody	AURION, Netherlands<
Copper grids, 100 Parallel Bar<	G2012C
Incubator	Major Ciência, EUA	MO-RC
Pioloform Powder	Agar scientific, UK	R1275
Chloroform<

td style='width:153pt;'>5,133td style='width:153pt;'> de alta pressãotd style='width:153pt;'> td style='width:153pt;'> td style='width:164pt;'>Olympus, Japan<td style='width:153pt;'>SZX10td style='width:153pt;'>E309.1td style='width:164pt;'>Werner & Mertz Professional, Germany<td style='width:153pt;'> td style='width:153pt;'>SANDURET 2- K < td style='width:164pt;'>JOKE Joisten & Kettenbaum, Alemanha<td style='width:153pt;'>955932td style='width:153pt;'>7001-0050td style='width:153pt;'>pan AMPAR-GP-Af580-1td style='width:153pt;'>DAR 10nmtd style='width:164pt;'>Agar scientific, UKtd style='width:164pt;'>Roth, Alemanha<td style='width:153pt;'>3313.1