Pletismografia e Eletromiografia Simultâneas em Modelo de Camundongo ALS

Resumo

Fonte: Jensen, V. N., et al. Medição repetida da atividade muscular respiratória e ventilação em modelos de camundongos com doença neuromuscular. J. Vis. Exp. (2017).

Este vídeo demonstra o método para registrar sinais simultâneos de pletismografia e eletromiografia em um modelo de camundongo ALS em movimento livre. O procedimento envolve o uso de eletrodos implantados e um transmissor para capturar a atividade muscular, juntamente com uma câmara de pletismografia para monitorar os padrões respiratórios, para investigar o papel dos músculos acessórios no camundongo com ELA.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Preparando o camundongo para a cirurgia

1. Escolha o mouse desejado para implantação (ou seja, SOD1(G93A) ou controle) e pese o animal.
   NOTA: A idade e o peso recomendados para um camundongo (macho ou fêmea) submetido a esta cirurgia são P56 - P120 e ≥ 24 g, respectivamente.
2. Anestesiar o camundongo sob isoflurano a 3,5% com uma taxa de fluxo de oxigênio de 2 L / min. Execute uma pitada do dedo do pé e uma pitada da cauda para certificar-se de que o mouse esteja totalmente anestesiado.
3. Uma vez anestesiado, remova o mouse da caixa de coleta e mantenha a anestesia por meio de um cone nasal, ajustando o nível de isoflurano para 1,5% e a taxa de fluxo de oxigênio para 1 L/min. Faça uma pinça do dedo do pé e/ou pinça da cauda para garantir que a anestesia seja mantida.
4. Aplique pomada oftálmica lubrificante para evitar que os olhos sequem durante a cirurgia.
5. Raspe o mouse para expor um local cirúrgico entre a orelha e o ombro (Figura 1C).
6. Prenda as unhas dos pés ipsilaterais ao local da cirurgia para reduzir a chance de o mouse puxar os eletrodos ou causar feridas ao coçar durante o processo de cicatrização.
7. Alterne o swab do local da cirurgia, primeiro com desinfetante e depois com isopropanol. Repita mais 2 vezes.

2. Implantando o dispositivo de telemetria para registrar a atividade de eletromiografia (EMG) escalena e trapézio

1. Coloque o animal embaixo de um microscópio de dissecação, de lado em cima de uma almofada estéril cobrindo uma almofada de aquecimento, e prenda o cone do nariz no lugar com fita adesiva. Observe que é melhor implantar o lado direito para reduzir o sinal do eletrocardiograma (ECG) originado do coração.
   NOTA: Monitore a respiração e ajuste os níveis de isoflurano, se necessário, para manter uma frequência respiratória regular e um plano cirúrgico apropriado de anestesia.
2. Puxe o membro anterior em direção ao pé ipsilateral ao longo do tronco.
   NOTA: Esta posição desloca a escápula caudalmente, proporcionando acesso cirúrgico aos músculos escaleno e trapézio.
   1. Pegue a pinça curva romba, segure a pata dianteira ipsilateral ao local da cirurgia e prenda a pata com fita adesiva no lugar (Figura 1C). Use fita cirúrgica adesiva forte para garantir que a pata esteja segura durante o procedimento.
3. Coloque um novo par de luvas cirúrgicas. Use o bisturi para fazer uma incisão oblíqua, com aproximadamente 2 cm de comprimento, entre o ombro e a orelha (linha vermelha em Figura 1C).
4. Usando duas pinças de laminectomia # 2, uma em cada mão, puxe a almofada de gordura para trás e afaste os músculos trapézio e platisma para expor a fáscia que cobre os músculos esternocleidomastóideo e escaleno (Figura 1D e E ).
5. Use o músculo esternocleidomastóideo pálido e o nervo frênico como pontos de referência para identificar os músculos escalenos. Observe que o nervo frênico corre paralelo aos músculos escalenos , enquanto o esternocleidomastóideo fica inferior. Os músculos escalenos correm obliquamente das vértebras cervicais para as costelas sob o músculo trapézio. Os eletrodos biopotenciais serão inseridos no músculo escaleno anterior, que pode ser identificado como o músculo que corre adjacente ao nervo frênico (Figura 1F e G).
   NOTA: Cuidado. Essa área é altamente vascularizada e deve-se tomar cuidado para evitar o corte da artéria subclávia. Evite danificar o nervo frênico e o plexo braquial.
6. Uma vez identificados os músculos escaleno e trapézio (Figura 1G), faça uma bolsa subcutânea para o transmissor no dorso do animal, entre as escápulas.
   1. Use a tesoura separadora de tecidos. Insira as pontas rombas logo abaixo da pele e espalhe-as até formar uma abertura de bolso com cerca de 1,25x a largura do transmissor (Figura 1H).
      NOTA: O transmissor deve ser inserido com resistência mínima, mas o bolso não deve ser tão grande que o transmissor possa se mover sozinho. Se a bolsa for muito pequena, o transmissor pode esfregar contra a pele, causando irritação que pode levar o animal a arranhar a pele e/ou puxar a guia para fora. Se a bolsa for muito grande, podem se formar seromas ou o transmissor pode migrar para uma posição desfavorável.
7. Lave com solução salina morna e estéril e insira o transmissor com o lado mais plano contra o músculo. Posicione o transmissor de forma que fique plano e os fios saiam do bolso, paralelos entre si, em vez de torcidos (Figura 1I). Enrole qualquer excesso de fio sob o dispositivo e coloque-o na horizontal.
8. Passe os eletrodos do transmissor para os músculos escaleno e trapézio de modo que os dois conjuntos de eletrodos bipotenciais fiquem planos e paralelos um ao outro.
9. Use a pinça de laminectomia para separar o escaleno anterior dos músculos circundantes e insira uma agulha de calibre 25 perpendicular às fibras musculares através do músculo escaleno.
   1. Insira um eletrodo na ponta da agulha e, em seguida, puxe a agulha para fora do músculo, deixando para trás o eletrodo inserido no músculo até o isolamento do fio (Figura 1J e K). Registre quais eletrodos coloridos são inseridos em qual músculo.
10. Coloque uma pequena gota de adesivo de cianoacrilato na extremidade exposta do fio, perto do músculo onde o eletrodo está inserido, e deslize rapidamente a tampa do eletrodo sobre o fio para que nenhum fio fique exposto entre a tampa do eletrodo e o músculo (Figura 2A e B).
    NOTA: Embora seja uma prática aceita proteger eletrodos EMG com cianoacrilato, um método alternativo é amarrar um nó de sutura de seda ao redor da tampa do eletrodo.
11. Apare o excesso de fio distal à tampa e aplique uma gota de adesivo de cianoacrilato na extremidade da tampa / fio de chumbo. Dê tempo à cola para polimerizar antes de liberar (Figura 2C e D).
12. Siga os mesmos passos (passos 3.10-3.12) para inserir o cabo de polaridade oposta paralelo ao primeiro no mesmo músculo, a 1 - 2 mm de distância do primeiro cabo.
13. Repita as etapas 3.10 a 3.12 para inserir eletrodos no músculo trapézio, que está localizado logo anterior ao músculo escaleno (Figuras 1L e M).
14. Certifique-se de que os fios estejam fixados no lugar e que haja folga suficiente para o animal realizar movimentos corporais sem puxá-los. Certifique-se de que qualquer excesso de comprimento de chumbo não empurre a pele, pois isso pode causar irritação que pode levar o animal a arranhar ou puxar o chumbo para fora. Reposicione os cabos, se necessário, para evitar qualquer desconforto potencial.
15. Remova cuidadosamente a fita que prende o membro anterior. Puxe a almofada de gordura de volta sobre o músculo e use-a para cobrir os eletrodos inseridos. Feche a incisão com adesivo de cianoacrilato juntando as abas da pele para que a incisão se alinhe. Aperte uma parte das abas de pele junto com a pinça curva e aplique uma pequena linha de adesivo de cianoacrilato ao longo desta linha.
16. Injete 0,1 mL de carprofeno por via subcutânea para aliviar a dor pós-operatória enquanto o animal ainda está sob anestesia.
    NOTA: Continue a administrar 0,1 mL de carprofeno uma vez ao dia por 1 a 2 dias após a cirurgia e, em seguida, conforme necessário depois disso.
17. Remova o animal do nariz e coloque-o em uma gaiola limpa na incubadora pré-aquecida até que esteja acordado e se movendo pela gaiola voluntariamente. Depois, mantenha o animal na incubadora por pelo menos 15 minutos, monitorando seus movimentos e estado de alerta.

3. Cuidados pós-operatórios

1. Animais domésticos separadamente após a cirurgia. Forneça aos animais curativos gel dietético e uma garrafa de água.
2. Monitore o animal nos primeiros 30 minutos após a cirurgia. Verifique o animal pelo menos a cada hora durante 5 horas após a cirurgia. Nos dias seguintes à cirurgia, verifique pelo menos duas vezes ao dia.
3. Fique atento a necrose, infecção ao longo da incisão e dentro da cavidade do corpo que contém o implante (, ou seja, calor, inchaço e vermelhidão) e formação de seroma.
   NOTA: Esses sinais ocorrem na primeira semana após a cirurgia. Figura 1N mostra um animal saudável e curado um mês após a cirurgia. Embora os registros de EMG possam ser feitos imediatamente após a implantação, os animais recebem pelo menos uma semana para cicatrizar antes de registrar EMG e pletismografia, pois os sinais de ECG podem ser altos imediatamente após a implantação.

4. Aquisição simultânea de sinais de eletromiografia e pletismografia

1. Ligue todos os equipamentos de aquisição, incluindo o fluxo de polarização.
   NOTA: A taxa de fluxo para camundongos é normalmente definida em 1.0 L/min.
2. Calibre a(s) câmara(s) de pletismografia usando um medidor de vazão.
   NOTA: Verifique periodicamente as câmaras de pletismografia para garantir que as vedações não estejam rachadas ou quebradas. Para manter seu bom estado, cubra as vedações de borracha com um lubrificante, como graxa a vácuo, uma vez por semana.
3. Calibração do transmissor de entrada conforme especificado pelo fabricante.
4. Coloque o mouse na câmara de pletismografia por pelo menos 1 h para aclimatá-lo antes de registrar EMG e pletismografia. Usando várias câmaras, é possível gravar de um mouse enquanto o próximo mouse está se aclimatando em uma segunda câmara. Não ligue o transmissor durante o período de aclimatação para economizar energia da bateria (Figura 1O).
5. Antes da gravação (mas após a calibração), ligue o transmissor colocando um ímã forte a 1 polegada do animal implantado; Uma luz vermelha na frente do receptor indicará quando o transmissor estiver ligado.
6. Comece a aquisição usando o menu suspenso "Aquisição" e escolha "Iniciar aquisição". Embora a duração da gravação possa variar de acordo com o experimento, uma pletismografia típica e gravação EMG dura de 1 a 3 h.
   NOTA: O transmissor tem uma taxa de amostragem intrínseca de 240 Hz. Uma taxa mais rápida de 500 Hz é definida no software para interpolar entre os pontos e fornecer uma forma de onda mais suave. O filtro passa-baixo (que serve como um filtro anti-alias) e o filtro passa-alta no implante especificam a largura de banda de 1 a 50 Hz para este dispositivo de telemetria. A interferência A/C de 60 Hz não contribui para o excesso de ruído no sinal EMG porque os implantes são alimentados por bateria e o animal protege o implante e os condutores de campos elétricos. Pletismografia, EMG e vídeo são sincronizados automaticamente em tempo real via software de aquisição.
7. Quando a aquisição estiver concluída, desligue o transmissor com um ímã e remova o animal da câmara.

Resultados

Figura 1. Implantação de dispositivo de telemetria para medir EMG muscular respiratório. (A) Transmissores de telemetria com dois pares de derivações biopotenciais para medir EMG. Os cabos podem s...

Materiais

< classe de figura='tabela' estilo='largura::656pt;'> < estilo td = 'largura: 164pt;'>Data Sciences Internationaltd style='width:164pt;'>Leica de chumbo transmissores de enrolamento de cianoacrilato< td estilo = 'largura: 164pt;'> Henry Schein Animal Health < estilo td = 'largura: 164pt; '> 29404 < estilo td = 'largura: 164pt; '> anestésico < estilo td = 'altura: 15,75 pt; '> álcool isopropílico 70% < estilo td = 'largura: 164pt;'> Cuidados prioritários 1 < estilo td = 'largura: 164pt; '> < estilo td = 'altura: 15,75pt; largura: 164pt; '> Dermacloro 2% Esfoliante Médico ( clorohexidina 2%) < estilo TD = 'largura: 164pt;'>Butler Schein

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
B6.Cg-Tg (SOD1*G93A)1 Gur/J	Jackson Laboratory	4435
Câmara de Pletismografia	Buxco Respiratory Products/ Data Sciences International	601-1425-001
Telemetry Receivers (Model RPC-1)	Data Sciences International	272-6001-001
Bomba de fluxo diagonal (modelo BFL0500)	601-2201-001
ACQ-7000 USB	Data Sciences International	PNM-P3P-7002XS
Dataquest A.R.T. Data Exchange Matrix	Data Sciences International	271-0117-001
New Ponemah Analysis System	Data Sciences International	PNM-POST-CFG
Ponemah Physiology Platform Acqusition software v5.20	Data Sciences International	PNM-P3P-520
Ponemah Unrestricted Whole Breath Plethysmography analysis package v5.20	Data Sciences International	PNM-URP100W
Configured Ponemah Software System	Data Sciences International	PNM-P3P-CFG
Analysis Module (URP)	Data Sciences International	PNM-URP100W
Universal Amplifier	Data Sciences International	13-7715-59
Sync Board	Data Sciences International	271-0401-001
Sync Cable	Data Sciences International	274-0030-001
Transducer-Pressure Buxco	Data Sciences International	600-1114-001
Medidor de vazão	Data Sciences International	600-1260-001
Ímã e rádio incluídos no F20-EET Starter Kit	Data Sciences International	276-0400-001
Axis P1363 Video Camera	Data Sciences International	275-0201-001
Terg-A-Zyme	Fisher Scientific	50-821-785	Enzyme Detergent
Actril	Minntech Corporation	78337-000	Chemical Sterilant
Stereo Dissecting Microscope (Modelo MEB126)<	10-450-508
Servo-Controlled Humidifier/Infant Incubator	OHMEDA Ohio Care Plus	6600-0506-803
TL11M2-F20-EET Transmitters	Data Sciences International	270-0124-001
Dumont #2 Laminectomy Forceps - Standard Tips/Straight/12cm (x2)	Fine Scientific Instruments	11223-20	For handling wires
Dumont #2 Laminectomy Forceps - Standard Tips/Straight/12cm (x2)	Fine Scientific Instruments	11223-20	For surgery
Narrow Pattern Forceps- Serrilhado/Curvo/12cm	Fine Scientific Instruments	17003-12
Spring Scissors - Tough Cut/Straight/Sharp/12.5cm/6mm Cutting Edge	Fine Scientific Instruments	15124-12
Tesoura de separação de tecidos - Straight/Blunt-Blunt/11.5cm	Fine Scientific Instruments	14072-10
Fine Scissors - Tough Cut/Curved/Sharp-Sharp/9 cm	Fine Scientific Instruments	14058-11	Para cortar fios e cortar pregos
Scalpel Handle #3	World Precision Instruments	500236
Scalpel Blade	Fine Scientific Instruments	10010-00	Para preparar tampas
Polysorb Braided Absorbable suture	Coviden	D4G1532X	Para cabos
Gluture	Zoetis Inc.	6606-65-1	Adesivo
3 mL Syring Slip Tip - Soft	Vitality Medical	118030055
25G Needle (X2)	Becton Dickinson and Co.	305-145
Cotton Tipped Applicators	Henry Schein Animal Health	100-9175
Andis Easy Cut Hair Clipper Set	Andis	049-06-0271	Electrical Razor vendido na Target
isoflurano
MS070PC
55482
Artificial Tears	Henry Schein Animal Health	48272	Lubricant Opthalmic Ointment
Vacuum grease	Dow Corning Corporação	1597418
Water Blanket	JorVet	JOR784BN