Induzindo hemorragia pontina maciça em um modelo de rato por injeção de sangue autólogo

Resumo

Fonte: Tang, X. et. al., Hemorragia Pontina Maciça por Injeção Dupla de Sangue Autólogo. J. Vis. Exp. (2021)

Este protocolo descreve a infusão controlada de sangue autólogo na região pontina do cérebro de um rato para modelar hemorragia pontina maciça. O objetivo é simular um sangramento cerebral localizado aumentando a pressão localizada.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Animal and instruments
2. Use ratos Sprague-Dawley machos de 8 semanas pesando 250 ± 10 g.
3. Alojar os ratos por pelo menos 7 dias antes da cirurgia sob condições ambientais controladas com temperatura ambiente de 25 °C, umidade relativa de 65% e um ciclo claro-escuro de 12/12 horas.
4. Forneça comida e água sem limite.
5. Prepare os instrumentos (Figura 1A-E).

2. Injete o sangue na ponte

1. Pese os ratos novamente 3 dias antes da cirurgia para selecionar ratos com peso corporal adequado para os experimentos.
2. Durante os 3 dias antes da modelagem, treine os ratos para andar na trave de equilíbrio 3 vezes por dia para garantir que os ratos normais possam passar pela trave de equilíbrio sem pausa.
3. Pré-aqueça a almofada de aquecimento a 37 °C antes da anestesia.
4. Anexe uma microbroca ao suporte na estrutura estereotáxica.
5. Injete nos ratos 50 mg/kg de cetamina e 5 mg/kg de xilazina por via intraperitoneal. Espere até que não haja resposta de beliscão.
6. Transporte o rato para o quadro estereotáxico em decúbito ventral. Coloque as barras auriculares acima do canal auditivo para prender a cabeça. Fixe o crânio na posição horizontal para evitar a inclinação da injeção (Figura 1F).
7. Manter a anestesia com isoflurano (97,5% de oxigênio e 2,5% de isoflurano) através de um cone de nariz estereotáxico com uma porta de entrada e saída.
8. Use pomada para os olhos para manter a córnea úmida.
9. Raspe o cabelo acima do crânio com um micro barbeador.
10. Desenhe uma linha média de 3 cm com uma caneta marcadora no crânio da linha do canto lateral bilateral até 0,5 cm atrás da fontanela posterior, conforme mostrado na Figura 1F.
11. Aplique o esfoliante cirúrgico Entoiodine de forma circular, começando no meio da linha média marcada e girando para fora.
12. Coloque o campo cirúrgico.
13. Faça uma incisão com bisturi ao longo da linha média marcada.
14. Use um cotonete para remover qualquer sangue em potencial.
15. Coloque um pedaço de pinça em cada lado do retalho do couro cabeludo para expor o crânio (Figura 1G).
16. Mergulhe um cotonete em solução salina a 0,9% e remova suavemente os tecidos conjuntivos do osso do crânio para evitar que os tecidos conjuntivos fiquem presos na microbroca.
17. Marque o ponto central do bregma como o ponto de origem por meio de um marcador.
18. Realize uma craniotomia (1 mm de diâmetro) usando uma microbroca em AP-9,0 mm, Lat 0 mm (Figura 2B e Tabela 1). Proceda com cuidado, pois este ponto está muito próximo ao seio venoso (Figura 1G).
19. Remova a microbroca do quadro estereotáxico.
20. Coloque uma seringa Hamilton de 100 μL no suporte estereotáxico (Figura 1K). Ligue o interruptor da bomba de injeção, clique no botão Inalação Rápida, aspire a solução de heparina (12500 U diluída em 100 mL de solução salina) para 100 μL e drene-a completamente para evitar a coagulação do sangue muito rápido.
21. < estilo de extensão = 'cor de fundo: transparente; cor: #1a202c; '> Aplique clorexidina e esfoliante cirúrgico com álcool 75% em toda a cauda da raiz às pontas pelo menos 3 vezes para desinfetar a pele, suavizar o tesão e dilatar a veia da cauda para aumentar a taxa de sucesso da injeção.
22. Anexe uma acupuntura do couro cabeludo a uma seringa de 1 mL.
23. Insira a acupuntura do couro cabeludo em uma veia da cauda lateral a 3 cm da ponta da cauda e retire 150 μL de sangue (Figura 1H).
24. Remova a acupuntura do couro cabeludo da seringa de 1 mL.
25. Transfira o sangue para um tubo (Figura 1I).
    NOTA: Transfira rapidamente para evitar a coagulação do sangue.
26. Troque as luvas cirúrgicas.
27. Escolha o modo Retirar, defina o volume para 100 μL, defina a velocidade para 200 μL/min, clique no botão RUN e aspire 100 μL de sangue para a seringa Hamilton (Figura 1J).
28. Escolha o modo Infuse e defina a velocidade em 1 μL/min.
29. Avance a seringa até que a ponta atinja 9,2 mm abaixo da superfície do cérebro (Figura 2C e Figura 1L).
30. Clique no botão Executar para injetar os primeiros 10 μL de sangue a uma velocidade de 1 μL/min (Tabela 1).
31. Pare a injeção e deixe a seringa na posição por 20 min para evitar que o sangue flua para o espaço subaracnóideo.
32. Retraia a seringa até que a ponta chegue a 9,0 mm abaixo da superfície do cérebro.
33. Reinicie a injeção na mesma velocidade de 1 μL/min até que o sangue residual tenha sido injetado completamente.
34. Deixe a seringa na posição por 10 min para evitar o refluxo do sangue.
35. Remova a seringa do cérebro lentamente.
36. Use cimento ósseo para cobrir o orifício da craniotomia.
37. Quando o cimento secar, suture a ferida com um filamento de sutura de poliamida 4-0. Depois de costurar 3 ou 4 pontos, amarre os nós cirúrgicos padrão 2-1-1.
38. Para prevenir a infecção, injete no rato penicilina (0,25 mL, 80 UI diluída em 4 mL de solução salina) por via intraperitoneal.
39. Injete os ratos por via subcutânea com tartarato de butorfanol (2,5 mg/kg) e repita a injeção a cada 2 horas para aliviar a dor pós-operatória até 24 horas após a cirurgia.
40. Observe o rato a cada 15 minutos até que ele se recupere totalmente da anestesia. Devolva-o à gaiola original, com uma almofada de aquecimento embaixo da gaiola. Forneça ao rato livre acesso a comida e água até o sacrifício.

Tabela 1: Injeção de sangue autólogo.

Mild	Moderate	Massive
Total volume	30 μL	60 μL	100 μL
First injection
Stereotactic coordinates	AP -9.0 mm; Lat 0; Vert -9,2 mm
Volume	10 μL	10 μL	10 μL
Speed	1 μL/min	1 μL/min	1 μL/min
Interval time	20 min	20 min	20 min
Second injection
Stereotactic coordinates	AP -9.0 mm; Lat 0; Vert -9,2 mm		AP -9,0 mm; Lat 0; Vert -9.0 mm
Volume	20 μL	50 μL	90 μL
Speed	1 μL/min	1 μL/min	1 μL/min
Before retirada da agulha	10 min	10 min	10 min
AP: posição ântero-posterior
Lat: lateral
Vert: vertical

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Resultados

Figura 1: Instrumentos e procedimento da cirurgia. (A) Máquina de anestesia. (B) Instrumentos cirúrgicos. (C) Microbroca. (D) Bomba de microinjeção. (E) Aparelho estereotáxico. (F) Uma linha é marcada no meio do crânio. (G) A seta amarela aponta para o local da perfuração. (H) Drenagem de sangue da veia da cauda. (I) Transfira o sa...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
100ml Saline solution	Guangdong yixiang	191222201 C1	Preparando diluente
100μl Microinjetor	Shanghai Gaoge		Injeção de sangue
1ml Seringa	Jiangsu Zhiyu	20191014	Retire o sangue autólogo da veia
75% Alcohol	Shandong Lierkang		Desinfecção da cauda
Fita adesiva	Shanghai Jinzhong		Instrumentos
Animal anesthesia system	RWD	R510-31S-6	Induzindo e mantendo anestesia<
Jiangsu Saiangsi		Para pontuações de déficit neurológico
Bone cement	Shanghai Xinshiji	20180306	Instrumentos
Butorphanol tartrate	Jiangsu Hengrui		Para controle da dor
Broca craniana elétrica	Nanjing Darwin biotechnology	20180090018	Fazendo um buraco de rebarba no crânio
EP tube	Nantong Surui		Transferir sangue
Creme para os olhos de eritromicina	Yunnan pharmacy		Proteção dos olhos
Heating pad	Dangerous Jungle	JR01	Mantendo-se aquecido
Injeção de heparina sódica	Chengdu Haitong Pharmacal Company	190701	Preparando diluente de heparina
IndoPhors	Guoyao of China		Esterilização
Isoflurano	RWD	20080701	Induzindo e mantendo a anestesia
Micro-injection pump	Baoding Leifu	TFD03-01-C	Injeção de sangue
Needle holder	Shanghai Jinzhong	J32020	Surgicl instruments
Penicilin	Guoyao of China		Infection Prevention
Q-tips	Jiangxi Songhe		Instrumentos
Scalp needle	Jiangxi Hongda	20200313	Retire o sangue autólogo da veia
Bisturi	Shanghai Kaiyuan	170902	Instrumentos
Tesoura de corte	Shanghai Jinzhong	Y00040	Surgicl instruments
Stereotaxiic apparatus	RWD	900-00001-00	Para posicionamento
Toalha cirúrgica	Xinxiang Huakangweicai	20070601	Instrumentos
Suture needle	Shanghai Jinzhong		Instrumentos
Tesoura de sutura	Shanghai Jinzhong	J25041	Surgicl instruments
Tissue holding forceps	Shanghai Jinzhong	J31080	Instrumentos Surgicl

de heparina autólogo da cauda de rato Surgicltd style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Balance beamSurgiclautólogoautólogo Surgicl da cauda Surgicl cirúrgico Surgicl Surgicl