$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.
1. Montagem dos óculos para ratos
- Prepare as peças necessárias para a montagem dos óculos (Figura 1a). Para cada mouse, prepare todos os seguintes: um bastão de náilon montado na cabeça, uma armação de titânio superior e uma inferior, duas lentes com potências adequadas de acordo com o objetivo do experimento, um parafuso tamanho M1.4 com comprimento de 10 mm, uma porca para parafuso tamanho M1.4, uma arruela plana para parafuso tamanho M1.4 com espessura de 0,3 mm, e duas pontas de unhas artificiais. NOTA: Existem dois tipos de armações com alturas diferentes. Para um mouse, um quadro superior e um quadro inferior são usados como um conjunto. Quadros mais altos devem ser colocados acima dos mais baixos para tornar os campos de visão simétricos. Armações e lentes são especialmente projetadas e fabricadas pelo grupo de pesquisa dos autores. Estes estão disponíveis entrando em contato com os autores correspondentes deste artigo. Outras peças podem ser encontradas em lojas de ferramentas de varejo.
- Monte a moldura para o olho direito e esquerdo separadamente.
- Disponha a ponta da unha voltada para a direção externa para obter o melhor efeito protetor. Ajuste o ângulo entre a ponta da unha e a armação para cerca de 130° para evitar mascarar o campo de visão do mouse (Figura 1b). Cole as pontas das unhas artificiais na armação usando adesivo de cianoacrilato.
NOTA: As pontas das unhas podem ajudar a proteger a lente de arranhões pelo mouse. A direção das pontas das unhas deve ser oposta porque a moldura superior e a moldura inferior são usadas para o olho direito e o olho esquerdo, respectivamente. - Aguarde pelo menos 12 h para deixar o adesivo secar completamente e, em seguida, use um cortador de unhas para ajustar o formato das pontas das unhas para cerca de 1 cm × 1 cm, cortando e aparando.
- Cole a lente na armação usando adesivo de cianoacrilato. Coloque a lente na armação com a mão e segure a armação horizontalmente. Injete o adesivo de cianoacrilato da borda da lente e deixe o adesivo se espalhar por tensão superficial.
NOTA: O adesivo irá corroer a lente e influenciar sua transparência, portanto, certifique-se de que o adesivo toque apenas na parte periférica da lente. Use 0 dioptrias (D) lente plana como controle e lente negativa para induzir miopia. O efeito de diferentes potências de lentes negativas (–10 D a –50 D) foi descrito em outro lugar4. Para maximizar a indução da miopia, uma lente –30 D é recomendada para induzir a miopia. O FDM também pode ser induzido com o mesmo dispositivo simplesmente trocando a lente na tampa do microtubo de 1,5 mL como difusor.
- Aperte o parafuso no bastão de náilon junto com a arruela do lado plano do bastão. Prepare os óculos e os bastões antes do experimento, respectivamente, e armazene-os para uso posterior (Figura 1c).
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
2. Fixação da estrutura no crânio do rato.
- Aplique uma gota de colírio de hialuronato de sódio purificado a 0,1% para evitar o ressecamento em cada olho.
NOTA: Os colírios na superfície ocular influenciarão os valores das medições de refração e comprimento axial. Não use o colírio após a anestesia até que todas as medições sejam feitas. - Coloque o queixo do rato anestesiado em uma encosta feita de argila ou qualquer coisa que possa ser usada como travesseiro para fazer com que o plano frontal do crânio fique horizontal.
- Esterilize o cabelo e o couro cabeludo entre as orelhas e os olhos usando um cotonete com etanol 70%.
- Corte a pele entre as orelhas e os olhos para expor o crânio por cerca de 0,8 sq.cm usando tesouras cirúrgicas e pinças. Use líquido de condicionamento dentário e um cotonete para remover o periósteo. Esterilize as tesouras e pinças cirúrgicas com etanol a 70% antes da cirurgia de cada camundongo.
NOTA: Pode ser necessário cortar o cabelo e usar luvas estéreis. Verifique as disposições do comitê de cuidados com animais relevante antes deste procedimento. Na maioria dos casos, o líquido de condicionamento dentário é um dos acessórios do sistema adesivo dental autopolimerizável. Se o líquido de condicionamento dentário não estiver disponível, use etanol a 70%. - Monte um conjunto de armações sem lente para ajudar a fixar o stick na posição correta. Coloque os quadros na cabeça do mouse. Ajuste cuidadosamente a posição das armações para garantir que ambos os olhos estejam no meio da moldura vazia.
- Use um sistema adesivo dental autopolimerizável para prender o bastão na cabeça do mouse. Tenha cuidado para não deixar o líquido do sistema de adesão fluir para o olho do mouse.
NOTA: O método de utilização do sistema adesivo dentário autopolimerizável é diferente entre os produtos. Consulte as instruções com atenção.
CUIDADO: Alguns dos reagentes no sistema adesivo dental podem ser tóxicos. - Aguarde cerca de 5 min e retire a moldura e a porca com cuidado, sem alterar a posição do bastão (Figura 2a).
- Injete 0,75 mg / kg de cloridrato de atipamezol por via intraperitoneal para ajudar o camundongo a se recuperar da anestesia mais rapidamente. Coloque o mouse em uma gaiola individual até que esteja totalmente recuperado. Não deixe o rato sem vigilância até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. O protocolo pode ser pausado aqui.
3. Início da indução da miopia e manutenção depois
- Aguarde pelo menos 24 horas após a cirurgia para que o camundongo se recupere completamente da anestesia. Segure o bastão e coloque as armações com lentes. O incentivo começa neste ponto de tempo (Figura 2b).
NOTA: Para minimizar o desconforto durante a recuperação da anestesia e dar tempo suficiente para o sistema adesivo dentário coagular, é altamente recomendável colocar a estrutura depois que os camundongos se recuperarem totalmente da anestesia. O cimento resinoso do sistema adesivo cobrirá totalmente o corte do couro cabeludo. Portanto, nenhum tratamento pós-cirúrgico específico é necessário para prevenir a infecção e melhorar a dor pós-cirúrgica. Logo após a primeira colocação do quadro, os ratos ficarão superconscientes da existência da lente e a arranharão muito. O comportamento bruto voltará ao normal após algumas horas. Os camundongos com lentes podem ser mantidos com a mesma densidade que os camundongos normais. - Remova a armação e limpe as lentes e as pontas das unhas com cotonetes pelo menos duas vezes por semana para manter a transparência da lente.
NOTA: Não é necessário colocar o mouse sob anestesia para remover e colocar a moldura. Fornecer suporte para os ratos se sentarem, em vez de pendurá-los enquanto trabalham com eles, pode reduzir o sofrimento. - Se for necessária uma medição provisória, coloque o camundongo sob anestesia e meça o camundongo conforme descrito anteriormente. A indução pode ser continuada após o camundongo se recuperar da anestesia.
- Limpe a gaiola pelo menos duas vezes por semana.
NOTA: Isso ajuda a manter a clareza da lente. Colocar uma rede entre o rato e o fundo da gaiola para filtrar os restos de comida também pode ser útil. - Monitore o peso corporal e o comportamento bruto. Compare-os com camundongos intocados da mesma idade durante todo o processo experimental.
NOTA: Exceto por alguns comportamentos de coçar, nenhuma mudança significativa, incluindo o peso corporal, é encontrada entre camundongos experimentais com camundongos não tratados.
