Impacto da privação e reoxigenação de oxigênio-glicose nas interações célula-célula

Resumo

Fonte: Alluri, H., et.al. Privação e reoxigenação de oxigênio-glicose como um modelo de lesão de isquemia-reperfusão in vitro para estudar a disfunção da barreira hematoencefálica. J. Vis. Exp. (2015).

O vídeo demonstra o impacto da privação de oxigênio-glicose e subsequente reoxigenação nas células endoteliais microvasculares do cérebro de ratos (RBMECs), simulando condições hipóxicas e carentes de nutrientes. Essas condições resultam em depleção de ATP, aumento do cálcio intracelular e geração de espécies reativas de oxigênio (ROS), que degradam as proteínas da junção celular e induzem a formação de fibras de estresse, enfraquecendo assim as interações célula-célula.

Protocolo

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p style='line-height:1.2;margin-bottom:0pt;margin-top:12pt;text-align:justify;' dir='ltr'>1. Semeadura de células endoteliais

1. Obtenha culturas primárias de RBMECs de ratos Sprague Dawley adultos (ou obtenha-as comercialmente).

2. Cultivar hemácias em placas de Petri revestidas com fibronectina (50 μg/ml) de 100 cm usando o crescimento de células endoteliais do cérebro de rato Média. Altere a mídia a cada dois dias até que a confluência seja alcançada.

3. Ao atingir 80-90% de confluência, lave suavemente as células em 5 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) por agitação. As células são então destacadas expondo-as a 1 ml de solução quente de ácido tripsina-etilenodiaminotetracético (EDTA) a 0,25%, equilibrada a 37 °C.

4. Incube as células a 37 °C por 2-5 min até que as células estejam separadas e dispersas. NOTA:<span style='font-family:Arial,sans-serif; tamanho da fonte:12pt; estilo da fonte:normal; variante de fonte: normal; peso da fonte: 400; decoração de texto:nenhuma; alinhamento vertical:linha de base; espaço em branco: pré-encapsulamento;' > Bata na placa de cultura para separar as células. Visualize as células ao microscópio para confirmar o desprendimento completo das células da superfície do prato.

5. Adicionar 5 ml de meio completo à placa de Petri para neutralizar a tripsina. Pipetar o meio que contém as células destacadas e recolhê-lo para um tubo de centrífuga de 15 ml.

6. Centrifugue o meio contendo células endoteliais a 220 x g por 5 min.

7. Aspirar o sobrenadante e conservar as células que contêm o sedimento. Suspenda o pellet em 3-5 ml de meio de crescimento de células endoteliais frescas do cérebro de rato, misturando-o suavemente para cima e para baixo com uma pipeta. As células serão então contadas usando um contador de células automatizado ou um hemocitômetro.

8. Transfira a suspensão celular para o sistema de lâminas de câmara estéril de 8 poços pré-revestido com fibronectina (50 μg/ml), 0,7 cm²/poço com uma densidade de semeadura variando entre 10.000-15.000 células por poço. Aumente as células a 37 °C até que a confluência seja alcançada NOTE:<span style='font-family:Arial,sans-serif; tamanho da fonte:12pt; estilo da fonte:normal; variante de fonte: normal; peso da fonte: 400; decoração de texto:nenhuma; alinhamento vertical:linha de base; espaço em branco: pré-encapsulamento;' > Para realizar western blots ou outros experimentos, as células podem ser cultivadas em placas de cultura de células de 10 cm ou placas especiais, conforme exigido pelo experimento.

2. Modelo In Vitro de Privação-Reoxigenação de Oxigênio e Glicose

1. Use o sistema de cultura de células de hipóxia para estudar os efeitos do OGD-R em RBMECs (consulte Figura 1). Configure e calibre o sistema de cultura de células de hipóxia antes de iniciar o experimento, de acordo com as instruções do fabricante.

2. Remova as lâminas da câmara confluente (passo 1.8) da incubadora a 37 °C. Substitua o meio completo na lâmina da câmara por meio de Eagle modificado (DMEM) desoxigenado, sem glicose, e colocado em câmara de hipóxia com 95% de nitrogênio e 5% de dióxido de carbono por 2 h a 37 ° C, para representar a condição OGD.

3. Mova as células de volta para a incubadora com 95% de oxigênio, 5% de dióxido de carbono a 37 ° C e fornecido com meio completo de células endoteliais frescas do cérebro de rato e incube por mais 1 hora a 37 ° C.

NOTA: Esta etapa representa uma situação de reoxigenação.

Resultados

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Proox model 110	Biospherix	Model 110
DMEM, sem glicose	Gibco, Life technologies	11966-025
Rhodamine Phalloidin	Life technologies	R415
ZO-1 Anticorpo Policlonal de Coelho	Life technologies	617300
Nunc Lab Tek II-CC 8 lâminas de vidro bem estéreis,	Thermo scientific	177402
FITC-tagged anti-rabbit secondary anticorpo	Santa cruz	sc-2090
DPBS 1X	Thermo scientific	SH 30028.03	Qualquer outro PBS disponível pode ser usado