Induzindo uma contusão da medula espinhal em um modelo de camundongo usando uma plataforma coaxial de lesão da medula espinhal

Resumo

Fonte: Elzat, E. Y. Y., et al., Estabelecendo um modelo de lesão medular por contusão em camundongos com base em uma técnica minimamente invasiva. J. Vis. Exp. (2022).

Este vídeo demonstra o método para induzir uma lesão de contusão na medula espinhal no nível T9 em um modelo de camundongo, usando uma plataforma coaxial de lesão da medula espinhal. Um peso é colocado na medula espinhal de nível T9 que cria uma contusão que causa imediatamente descoloração e inchaço do tecido.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Localização e laminectomia da^9ª vértebra torácica (T9)

NOTA: Camundongos C57BL/6J fêmeas de 9 a 10 semanas de idade foram comprados da Jinan Pengyue Experimental Animal Company (Jinan, China).

1. Autoclave um conjunto de instrumentos cirúrgicos para o experimento e esterilize a mesa de operação com álcool 75% antes da cirurgia.
2. Injete buprenorfina para analgesia (0,05-2,0 mg/kg, por via subcutânea) 30 minutos antes da anestesia para operações de lesão. Em seguida, anestesiar o camundongo com isoflurano (indução: ~ 3-5%, manutenção: ~ 1,5-2%). Verifique se o animal está totalmente anestesiado pelos reflexos da pinça da cauda ou do dedo do pé. Assim que a anestesia estiver em vigor, coloque o mouse em decúbito ventral em uma parte designada da mesa de operação e cubra a córnea com pomada oftálmica (aplique pomada oftálmica nas córneas para proteger os olhos do ressecamento durante a cirurgia).
   1. Raspe o cabelo da caudal para a rostral com um barbeador elétrico sobre a coluna toracolombar. Esterilize a pele várias vezes em movimentos circulares com iodóforo por 30 s, seguido de álcool 75%. Aplique um campo cirúrgico estéril e faça uma incisão longitudinal de aproximadamente 1,5 cm na pele de aproximadamente a^6ª vértebra torácica (T6) até a^13ª vértebra torácica (T13) com bisturi e lâmina.
      NOTA: Palpe ao longo da margem costal até a linha média, onde está localizada a^12ª vértebra torácica (T12) - espaço interespinhoso T13. Faça uma incisão de 1,5 cm no rostral, e a incisão está aproximadamente nivelada com as vértebras T6-T13.
3. Explore a^13ª costela de um lado da porção óssea sob o microscópio operacional. Explore o processo espinhoso na linha média tocando levemente a área do ângulo costovertebral e depois em direção ao rostral para localizar o espaço interespinhoso do T12-T13. Explore o espaço interespinhoso da T9 -^10ª vértebra torácica (T10) do espaço do T12-T13 para o lado rostral. (Figura 1A, 2A)
4. Dissecção o músculo paraespinhal ao longo do processo espinhoso do T9 até as articulações facetárias anterior e posterior de ambos os lados com microtesoura (Figura 2B). Retraia os músculos paraespinhais com micro-afastadores e limpe os tecidos moles da lâmina e no espaço interespinhoso da^8ª vértebra torácica (T8) - T9 e T9-T10 com microtesoura.
5. Realize a laminectomia T9, prenda o processo espinhoso de T9 com pinça de microcirurgia, levante-o levemente, insira a microtesoura paralelamente ao longo do lado dorsolateral direito da lâmina, evitando danos à medula espinhal, e corte a lâmina com micro tesoura. Repita no lado esquerdo e a medula espinhal pode ser exposta (Figura 1B, 2C).
6. Antes de fixar a vértebra, afrouxe o braço universal e prenda lentamente as articulações da^9ª à^10ª faceta em ambos os lados da vértebra com a pinça micro mosquito do estabilizador vertebral. Aperte os parafusos na pinça micro mosquito e a vértebra fica estabilizada. Ajuste a medula espinhal para o plano horizontal, aperte o braço universal e fixe a vértebra (Figura 2D).

2. Lesão de contusão T9

Uma vez que a medula espinhal de nível T9 esteja exposta e a vértebra fixada, aponte para a medula espinhal pela ponta dentro da manga sob o microscópico de operação (Figura 2E).

2. Verifique se a superfície da ponta é paralela à medula espinhal a partir dos aspectos posterior e lateral da medula espinhal, pois é fácil observar a relação entre a medula espinhal e a ponta sob o microscópio, e a mesa de operação pode ser girada facilmente.
3. Verifique se a superfície da ponta é paralela às bordas bilaterais da lâmina poupada antes que a ponta entre em contato com a medula espinhal após a laminectomia, pois é um plano de referência natural paralelo à medula espinhal.
4. Depois de localizar o espaço interespinhoso do T12-T13, baixar a manga até que a extremidade do impactor seja consistente com a marca na janela de observação e a altura especificada de 22 mm seja alcançada. Puxe o pino de puxar para liberar o peso (1,3 g, 2,0 g ou 2,7 g de acordo com o grupo, com cada grupo incluindo 3 camundongos e cada grupo tendo um mouse para cada ponto de tempo).
   NOTA: A medula espinhal deve estar paralela ao solo e perpendicular à ponta; mova a mesa cirúrgica para garantir o campo visual microscópico, pois a mesa é muito compacta.
5. Remova o impactor quando a contusão terminar e observe o grau de lesão da medula espinhal (SCI) sob o microscópio cirúrgico. No grupo leve, pode-se observar alteração da cor vermelha clara, enquanto no grupo moderado, o local da lesão exibe vermelho escuro em 3-4 s e, possivelmente, pode-se observar eminência. No grupo grave, as manifestações vermelho-escuras podem aparecer imediatamente, e eminência óbvia na dura-máter se manifesta, mas a dura-máter ainda está em uma forma consistente (Figura 2F).

Resultados

Figura 1. Um gráfico de imagem do método de localização da vértebra costovertebral T13. (A) A 13^ª costela e T13 são estruturas anatômicas relativamente constantes. O ângulo costovertebral T13 pode ser facilmente detectado ao microscópio, a partir do qual o operador pode sondar o processo espinhoso e encontrar o espaç...

Materiais

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Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ethanol	Fuyu Reagent	64-17-5
Microscópio fluorescente	KEYENCE	BZ-X800
Mice	Jinan Pengyue Experimental AnimalCompany	C57BL/6J
Aparelho de microcirurgia	Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd	Todos os instrumentos cirúrgicos são feitos sob medida	Tesouras oftálmicas, micro pinças de mosquito, pinças de microcirurgia, micro tesouras
RWD Estação anestésica de inalação de laboratório	RWD Life Science Co., Ltd	R550
Small animal in vivo microCT imaging system	PerkinElmer	Quantum GX2
Plataforma coaxial de lesão medular	Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd	Custom-made (padrão de Feng)	(https://shop43957633.m.youzan.com/wscgoods/detail/367x5ovgn69q18g?banner_id=f.81386274~goods.7~1~ b0yRFKOq&alg_ id=0&slg=tagGood List-default%2COpBottom%2Cuuid %2CabTraceId&components_style_ layout=1&reft=1659409105184&sp m=g.930111970_f.81386274&alias =367x5ovgn69q18g&from_uuid=136 2cc46-ffe0-6886-2c65-01903dbacbb a&sf=qq_sm&is_share=1&shopAuto Enter=1&share_cmpt=native_ wechat&is_silence_auth=1)