Imunoprecipitação da cromatina nativa de células da neuroesfera

Resumo

Fonte: Mendez, F. M. et al., Imunoprecipitação de cromatina nativa usando neuroesferas de tumor cerebral murino. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo demonstra o isolamento de complexos proteína-DNA de células neuroesféricas derivadas de um tumor cerebral de camundongo usando imunoprecipitação de cromatina nativa. Ele detalha as etapas de preparação da cromatina, imunoprecipitação, lavagem e digestão de proteínas para liberar DNA para análise posterior.

Protocolo

1. Imunoprecipitação de cromatina nativa (ChIP)

1. Preparação de cromatina
   1. Depois de fazer o estoque de células derivadas da neuroesfera (NS), cultive NS em um frasco T-75 em 15 mL de meio NSC a 37 ° C em uma incubadora de cultura de tecidos com uma atmosfera de 95% de ar e 5% de CO₂ até que o NS se torne confluente. Uma placa T-75 confluente produzirá 3-5 X 10⁶ células.
   2. Quando as células se tornarem confluentes, centrifugue NS a 300 x g por 5 min, decanta o sobrenadante e adiciona 1 mL de meio de dissociação celular. Incubar as células a 37 °C durante 5 min. Adicione 5 mL de meio e conte as células usando um hemocitômetro.
      NOTA: 1 x 10⁶ células são necessárias por reação de imunoprecipitação (IP). Observe que um soro pré-imune ou controle de IgG também deve ser incluído.
   3. Centrifugue o NS em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL a 300 x g por 5 min, transvase o sobrenadante e ressuspenda o pellet NS com 1 mL de solução salina balanceada e transfira a suspensão para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL de baixa ligação a proteínas.
   4. Centrifugue NS a 300 x g por 5 min, transvase o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 95 μL de tampão de digestão (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM CaCl₂, 0,2% de éter octilfenílico de polietilenoglicol) por 1 x 10⁶ células suplementadas com coquetel de inibidores de protease em alta concentração (1:100). Pipete imediatamente as células para cima e para baixo para evitar aglomeração e evitar a criação de bolhas.
   5. Ressuspenda a nuclease microcócica (MNase) em glicerol a 50% para fazer uma solução de 1 mg/mL (1,15 unidades/μL, armazenada a -20 °C) que será referida como estoque "1x". Faça um estoque "0,1x" fazendo uma segunda diluição 1:9 com 50% de glicerol (por exemplo, 900 μL de "1x" MNase e 100 μL de 50% de glicerol) e armazene-o a -20 °C.
   6. Misture 5 μL de "0,1x" MNase e 145 μL de tampão de digestão. Mantenha a enzima no gelo o tempo todo. Adicione 5 μL de MNase diluída no tampão de digestão por 1 x 10⁶ células. Agite o tubo para misturar e coloque o tubo em bloco de 37 °C por exatamente 12 min. Processe as amostras uma de cada vez para garantir um tempo de incubação preciso de 12 min.
   7. Adicione 10 μL de 10x MNase Stop Buffer (110 mM Tris-HCl, pH 8,0, 55 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)) por 1 x 10⁶ células. As amostras devem ser mantidas em gelo a partir deste ponto.
   8. Adicionar 110 μL "2x tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA)" (280 mM NaCl, 1,8% de éter octilfenílico de polietilenoglicol, 0,2% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 0,2% de Na-desoxicolato, 5 mM de etilenoglicol-bis (éter β-aminoetílico)-N,N,N',N'-ácido tetraacético (EGTA); armazenado a 4 °C) suplementado com coquetel de inibidores de protease em alta concentração (1:100) por 1 x 10⁶ células. Agite o tubo para misturar.
   9. Centrifugue os tubos por 15 min em uma microcentrífuga a 4 °C e 1700 x g. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga regular de 1,5 mL (tubos de microcentrífuga de baixa ligação a proteínas não são mais necessários) e armazene-os no gelo. Descarte o pellet.
      
2. Immunoprecipitation (IP)
   1. Misture as esferas magnéticas da Proteína A e da Proteína G na proporção de 1:1. Para cada IP, prepare 25 μL de esferas.
   2. Lave as esferas adicionando 1 mL de tampão RIPA (10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, 140 mM NaCl, 1% de éter octilfenílico de polietilenoglicol, 0,1% SDS, 0,1% de Na-desoxicolato; armazenado a 4 °C) suplementado com inibidores de protease em baixa concentração (1:1000).
   3. Use um ímã para permitir que as contas se separem da solução de lavagem e decantar a solução de lavagem (aproximadamente 1 min). Execute a etapa de lavagem duas vezes.
   4. Ressuspenda as esferas até o volume original usando tampão RIPA suplementado com inibidores de protease (1:1000).
   5. Se necessário, diluir a cromatina usando tampão RIPA suplementado com inibidores de protease (1:1000) para que cada IP tenha um volume de 100-200 μL. Reserve 10% do volume usado por IP de cromatina para a entrada.
      NOTA: Por exemplo, se 200 μL forem usados por IP, 20 μL de cromatina diluída devem ser reservados para a entrada. Para um total de quatro IPs, o volume total da cromatina deve ser diluído para 820 μL.
   6. Prepare a entrada. Adicione 100 μL de tampão TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) suplementado com proteinase K (0,5 mg / mL) à entrada e incube a entrada a 55 ° C por 1 h.
   7. Purifique a entrada usando um kit de purificação de reação em cadeia da polimerase (PCR) seguindo as instruções do fabricante e elua em 50 μL de tampão de eluição fornecido no kit.
   8. Meça a concentração da entrada usando um espectrofotômetro de microvolume e registre os resultados em um caderno. Blank com tampão de eluição do kit.
      NOTA: Em neuroesferas de camundongos, usamos aproximadamente 6 μg de DNA para cada IP.
   9. Execute a entrada em um gel a 1% ou carregue 1 μL em um DNA Bioanalyzer usando as configurações padrão. Armazene o restante para uso como entrada em aplicativos downstream.
   10. Adicione 10 μL de esferas magnéticas de proteína A e G lavadas para cada IP e incube IP por 1 h a 4 °C.
       NOTA: Por exemplo, adicione 30 μL de esferas magnéticas de proteína A & G para três IPs.
   11. Coloque as amostras em um ímã e deixe as contas se separarem. Divida a cromatina transferindo a quantidade previamente determinada para um novo tubo de 1,5 mL.
   12. Adicione o anticorpo e envolva as tampas com filme plástico de parafina para evitar a evaporação. Incubar as amostras durante a noite a 4 °C com rotação a 20 rpm.
       NOTA: A concentração deve ser determinada empiricamente seguindo as recomendações do fabricante.
   13. No dia seguinte, gire os tubos usando uma mini centrífuga em temperatura ambiente, 2000 x g, por 10 s. Em seguida, adicione 10 μL de grânulos a cada IP e incube o IP por 3 h a 4 ° C com rotação a 20 rpm.
       
3. IP Washes and Protein Digestion
   1. Adicione 150 μL de tampão RIPA suplementado com inibidores de protease em baixa concentração (1:1000) a cada IP e incube IP a 4 °C com rotação a 20 rpm por 5 min. Coloque a amostra em um suporte magnético e deixe as esferas magnéticas se separarem. Use uma pipeta para remover o sobrenadante. Repita esta etapa cinco vezes.
   2. Adicione 150 μL de tampão de cloreto de lítio (LiCl) (250 mM LiCl, 10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,5% NP-40, 0,5% Na-desoxicolato; armazene a 4 °C) suplementado com inibidores de protease em baixa concentração (1:1000) a cada IP e incube IP a 4 °C com rotação a 20 rpm por 5 min. Coloque a amostra em um suporte magnético e deixe os grânulos magnéticos se separarem. Use uma pipeta para remover o sobrenadante.
   3. Adicione 150 μL de Tris-EDTA (TE) frio (sem inibidores de protease) e incube a amostra a 4 °C com rotação a 20 rpm por 5 min. Coloque a amostra em um suporte magnético e deixe os grânulos magnéticos se separarem. Use uma pipeta para remover o sobrenadante.
   4. Após a etapa final de lavagem, ressuspender a amostra em 100 μL de tampão TE suplementado com proteinase K (0,5 mg/mL) e incubar a amostra a 55 °C por 1 h.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent	G2946-90004	bioanalyzer
AccuSpin Micro 17R, refrigerado	Fisher Scientific	13-100-676
C57BL/6	Taconic	B6-f	C57BL/6 mouse
Calcium Chloride	Aldrich	22350-6	buffer reagent
D-Luciferina, Sal de Potássio	Goldbio	LuckK-1g
DiaMag1.5 magnetic rack	Diagenode	B04000003	para lavagens de esferas magnéticas
DiaMag Rotator EU	Diagenode	B05000001	rotator
DMEM/F-12	Gibco	11330-057	NSC component<
Dynabeads Protein A	Thermo Fisher Scientific	10001D	protein A contas magnéticas
Dynabeads Protein G	Thermo Fisher Scientific	10003D	protein G magnetic beads
EGF	PeproTech	AF-100-15	prepare 20 μg/mL de estoque em 0,1% BSA e alíquota.
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)<	E-4884	buffer reagent
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-ácido tetraacético) (EGTA)	Sigma	E-4378	buffer reagent
Fetal Bovine Serum	Gibco	10437028	para congelar células
FGF	PeproTech	100-18b	Prepare o estoque de 20 μg/mL em 0,1% BSA e alíquota.
Forceps	Ferramentas de Belas Ciências	11008-13	para dissecção do tumor
Glicerol, MB Grade	EMD- Millipore	356352
HBSS	Gibco	14175-103	balanced salt solution
Fluriso	VETone	501017	anestésico inalatório
Ivis Spectrum	Perkin-Elmer	124262	in vivo optical imaging system
Hyqtase	HyClon	SV3003001	cell mídia de descolamento
Lithium Chloride	Sigma	L8895	buffer reagent
Microtubos de baixa ligação	Corning Costar	CLS3207	low tubo de microcentrífuga de ligação a proteínas
Tubo de microcentrífuga	Fisher	21-402-903	regular microcentrifuge tube
Nuclease microcócica	Thermo Fisher Scientific, Affymetrix	70196Y	Cada lote pode ser diferente; comprar quantidade suficiente para experimentos e alíquotas.
N2	Gibco	17502-048	NSC component<
Normocin	Invivogen	NOL-36-063	agente antimicrobiano, use a 0,1 mg/mL.
NP-40 (Igepal CA-630)	Sigma	18896-50ML	buffer reagent
Kimble Kontes Pellet Pestle	Fisher Scientific	K749515-0000
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	P8340	aliquot e armazene a -20 °C.
Protinase K	Sigma-Aldrich	P2308	make 10 mg/mL de estoque em água; alíquota e armazenar a -20 °C.
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	Kit de purificação de DNA
Scalpel	Ferramentas de Belas Ciências	10007-16	for dissection of tumor
Cloreto de sódio	VWR	0241-5KG	buffer reagent
Sodium Deoxycholate	Sigma-Aldrich	D670-25G	buffer reagent
Dodecil sulfato de sódio (SDS)	Sigma	L-4390	buffer reagent<
Tris Base	Thermo Fisher Scientific	Bp152-1	buffer reagent
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	BP 151-500	polyethylene glycol octylphenyl ether
Mini Centrífuga Padrão	Fisherbrand	12-006-901	mini centrífuga padrão
microscópio SZX16	Olympus	SZX16	microscópio de dissecação fluorescente
Nanodrop One	Thermo-Fisher Scientific	ND-ONEC-W

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