Realizando hibridização in situ de fluorescência dupla para detectar a expressão gênica em seções cerebrais de camundongos

Resumo

Fonte: Jolly, S., et.al. Combinando hibridização de fluorescência dupla in situ com imunomarcação para detecção da expressão de três genes em seções cerebrais de camundongos. J. Vis. Exp. (2016).

Este vídeo demonstra o uso de hibridização in situ de fluorescência dupla para visualizar a expressão de dois alvos de RNA em seções cerebrais de camundongos. O protocolo envolve a detecção sequencial de RNA usando sondas marcadas com isotiocianato de fluoresceína e digoxigenina, seguida de amplificação de sinal enzimático para aumentar a sensibilidade. A fluorescência resultante permite a análise de co-localização dos RNAs alvo dentro do tecido.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Hibridização

1. Prepare o tampão de lavagem a 65 °C: 150 mM NaCl, 15 mM Na₃C₃H₅O(COO)₃ (= 1x citrato de sódio salino), 50% (v/v) formamida e 0,1% (v/v) Tween-20.
2. Prepare o tampão MABT: 100 mM de ácido maleico, 150 mM de NaCl, 0,1% (v/v) Tween-20, pH 7,5.
3. Dilua as duas sondas (marcadas com DIG e marcadas com FITC) 1/1.000 em tampão de hibridização (água deionizada tratada com DEPC com 50% (v/v) de formamida deionizada, 200 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM NaH₂PO₄, 5 mM Na₂HPO₄, 0,01 mg/ml de tRNA de levedura, 1× solução de Denhardt e 10% p/v de sulfato de dextrana) pré-aquecido a 65 °C e misture bem.
4. Aplique cerca de 300 μl de mistura de hibridização em cada lâmina, aplique lamínula com lamínulas assadas no forno (200 °C) e incube O/N a 65 °C em uma câmara umidificada.
5. Transfira as lâminas para um frasco Coplin contendo tampão de lavagem pré-aquecido. Lavar as lâminas durante 30 min duas vezes a 65 °C com tampão de lavagem.
6. Lave as lâminas por 10 min três vezes com MABT em RT.

2. Visualização da sonda

1. FITCPrepare o tampão de bloqueio ISH: MABT com 2% de reagente bloqueador e 10% de soro de ovelha inativado por calor.
2. Opcional: use uma caneta hidrofóbica para desenhar círculos ao redor das seções de tecido na lâmina para reduzir o volume de soluções de anticorpos necessárias.
3. Incube as lâminas por 1 hora em RT com tampão de bloqueio ISH em uma câmara umidificada.
4. Incubar as lâminas O/N a 4 °C com um anticorpo anti-FITC conjugado com peroxidase de rábano (POD) diluído a 1/500 (v/v) em tampão de bloqueio ISH.
5. Coloque os slides em um frasco Coplin contendo PBS com 0,1% (v/v) Tween-20 (PBST). Lave 3 vezes por 10 min em PBST e substitua por PBST novo a cada vez.
6. Imediatamente antes de usar, prepare a tiramida fluorescente diluindo 100 vezes no diluente de amplificação. Para este exemplo, use FITC-tiramida.
7. Adicione isso aos slides e deixe por 10 min no RT.
8. Coloque as lâminas em um frasco de Coplin e lave 3 vezes em PBST por 10 min.

3. Visualização da sonda

1. DIGPrepare 0,1 M Tris-HCl pH 8,2.
2. Incube os slides com buffer de bloqueio ISH por 1 hora em RT.
3. Incubar as lâminas O/N a 4 °C com um anticorpo anti-DIG conjugado com fosfatase alcalina (AP) diluído a 1/1.500 (v/v) em tampão de bloqueio ISH.
4. Lave com MABT por 10 min três vezes.
5. Lave duas vezes com 0,1 M Tris-HCl pH 8,2 por 5 min em RT.
6. Imediatamente antes de usar, prepare a solução Fast Red dissolvendo os comprimidos em 0,1 M Tris pH 8,2. Filtrar a solução através de um filtro de 0,22 μM.
7. Incubar as lâminas a 37 °C com solução Fast Red em uma câmara umidificada. Como o tempo para o desenvolvimento ideal varia, verifique as lâminas regularmente com um microscópio fluorescente para monitorar a formação de precipitado. Para este exemplo, pare a reação após 2 a 3 horas.
8. Lave com PBST por 10 min três vezes.

Materiais

< >< table class = 'ck-table-resized'> < col style = 'width: 37,65%;'>< col style = 'width: 23%;'>< col style = 'width: 18,57%;'>< col style = 'width: 20,78%;'>Lista de materiais utilizados neste artigo Nome Empresa Número de catálogo Comentários < td style = 'border-top-style: none; height: 15,75pt; width: 221pt; '>Superfrost plus slides Thermo ScientificJ1800AMNZ Sodium citrateSigmaS4641para buffer de lavagem de 65 ° CFormamideSigma-AldrichF7503 Tween-20Sigma-AldrichP1379 CoverslipsVWR International631-0146 Coplin JarSmith Scientific Ltd2959 Blocking reagentRoche11096176001 Soro de ovelha inativado por calorSigmaS2263 Hydrophobic penCosmo BioDAI-PAP-S09:20α-FITC POD-conjugated antibodyRoche11426346910 TSA™ Plus Fluorescein SystemPerkin ElmerNEL741001KT26:00:00α-DIG Conjugado com APRoche11093274910 Fast red tabletsRoche11496549001 Mounting mediumDakoS3023 Leica SP2 confocal microscopeLeica .22 μM filter Millex SLGP033RS Deionized formamida Sigma F9037 para buffer de bloqueio ISHSodium chloride Sigma S3014 Ácido clorídrico VWR International20252.29 Sodium phosphate monobasic
anhydrousSigma S8282 Sodium phosphate dibasic dihydrateSigma 30435 Yeast tRNA Roche 10109495001 50x Solução de Denhardt Life Technologies 750018Dextran sulfatoSigma D8906 Acetato de sódio SigmaS2889 Trizma Base Sigma T1503