Coloração por imunofluorescência de tecido fibrovascular doente derivado de paciente embebido em gel

Resumo

Fonte: Gucciardo, E., et. al., Um modelo de cultura de tecidos ex vivo para complicações fibrovasculares na retinopatia diabética proliferativa. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo detalha um protocolo de imunocoloração para culturas ex vivo de tecido fibrovascular embebido em gel de fibrina. Isso permite a visualização detalhada das alterações vasculares associadas à retinopatia diabética proliferativa

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Coloração de imunofluorescência de montagem total

< estilo de extensão = 'cor de fundo: transparente; cor: #1a202c; '>NOTA: Este protocolo dura 5 dias e pode ser interrompido com incubações noturnas, quando indicado. Não deixe os géis de fibrina secarem em nenhum momento. Todas as etapas são executadas em RT, salvo indicação em contrário.

1. Prepare as seguintes soluções antes de iniciar o protocolo de coloração.
   1. Solução pós-fixação: prepare a solução 50:50 de acetona:metanol misturando quantidades iguais de acetona e metanol (por exemplo, 50 mL). Conservar a -20 °C. Preparar esta solução o mais tardar no dia anterior à coloração. Esta solução pode ser armazenada a -20 °C e ser usada para colorações subsequentes.
      NOTA: Prepare esta solução em capela de exaustão, pois a acetona e o metanol são inflamáveis e perigosos para a saúde.
   2. Solução de bloqueio: prepare uma solução de soro fetal bovino (FBS) a 15% e etoxilato de octilfenol a 0,3% em PBS, adicionando primeiro 15% de FBS ao PBS. Adicione o etoxilato de octilfenol e mexa para dissolver. Conservar a 4 °C.
      NOTA: Esta solução pode ser preparada em grandes quantidades com antecedência, armazenada em alíquotas de 15 mL a -20 °C e descongelada antes do uso no dia em que o protocolo de coloração é iniciado. Use alíquotas recém-preparadas ou recém-descongeladas para cada protocolo de coloração.
   3. Solução de lavagem: Prepare 1 L de PBS suplementado com 0,45% de etoxilato de octilfenol adicionando 4,5 mL de etoxilato de octilfenol a 995,5 mL de PBS. Mexa para dissolver. Armazene na RT.
2. Levante as gotas cuidadosamente da placa usando uma espátula de borda quadrada de aço inoxidável. Separe a gota primeiro das bordas antes de levantar o centro e transfira para um poço de placa de 12 poços contendo 1 mL de PBS.
   NOTA: Execute as etapas de pós-fixação, lavagens e bloqueio neste formato de placa.
3. Fixe as gotículas com 1 mL de solução gelada de acetona:metanol 50:50 por ~1 min (a borda das gotículas ficará branca).
   NOTA: Execute esta etapa na capela de exaustão, pois a acetona e o metanol são perigosos para a saúde.
4. Enxágüe com 3 a 5 lavagens em 2 mL de PBS (as gotículas afundarão na solução de PBS quando a reidratação estiver completa).
   NOTA: Evite tocar nas gotículas com a ponta da pipeta, pois, após a pós-fixação, elas ficam grudadas no plástico. Ao longo do protocolo, evite aspirar soluções pós-fixação, anticorpos, bloqueio e lavagem por sucção, pois isso pode danificar ou destruir completamente as gotículas. Em vez disso, incline a placa e remova cuidadosamente as soluções usando uma pipeta de 500-5.000 μL.
5. Centrifugue a solução de bloqueio por 15 min a 21.000 x g e 4 °C para remover os detritos.
   NOTA: A solução pode ser aliquotada em tubos de 1,5 mL para centrifugação. A solução não utilizada pode ser conservada a 4 °C e utilizada em todas as etapas subsequentes pertinentes.
6. Incube as gotículas em solução de bloqueio de 500 μL por 2 h em RT.
   NOTA: Para reduzir o volume da solução de bloqueio usada, a placa pode ser inclinada em um suporte e apenas 300 μL de solução/gotícula podem ser usados.
7. Preparar a mistura de anticorpos primários (pelo menos 30 μL/gotícula) na diluição adequada na solução de bloqueio e centrifugar durante 15 min a 21.000 x g e 4 °C.
8. Transferir as gotículas para uma placa de 96 poços com fundo redondo (U) utilizando uma espátula de arestas arredondadas e incubar com, pelo menos, 30 μL/gotícula da mistura de anticorpos primários durante a noite a 4 °C.
9. No dia seguinte, transfira as gotículas para uma placa de 12 poços contendo 2 mL de solução/poço de lavagem, enxágue com três lavagens de 5 min primeiro e depois com nove lavagens de 30 min. Deixe a última lavagem (2 mL) durante a noite a 4 °C.
10. No dia seguinte, enxágue três vezes com PBS e transfira as gotículas para uma placa redonda de 96 poços com fundo (U).
11. Durante as lavagens, prepare a mistura apropriada de anticorpos secundários conjugados com fluoróforo (diluída a 1:500, pelo menos 30 μL/gota) em solução de bloqueio e centrifugue por 15 min a 21.000 x g e 4 °C.
12. Transferir as gotículas para uma placa de 96 poços com fundo redondo (U) utilizando uma espátula de arestas arredondadas e incubar com, pelo menos, 30 μL da mistura de anticorpos secundários, durante 4 h a RT, protegida da luz.
    NOTA: Execute todas as incubações subsequentes e etapas de lavagem protegidas da luz.
13. Transfira as gotículas para uma placa de 12 poços contendo 2 mL de solução/poço de lavagem usando uma espátula de borda arredondada, enxágue com três lavagens de 5 min primeiro e depois com quatro lavagens de 30 min. Deixe a última lavagem (2 mL) durante a noite a 4 °C.
14. No dia seguinte, enxágue os géis com cinco lavagens de 30 min e depois três vezes com PBS. Deixe a última lavagem (2 mL) durante a noite a 4 °C.
15. No dia seguinte, transfira as gotículas para uma placa redonda (U) de 96 poços usando uma espátula de borda arredondada e contracore os núcleos incubando com 10 μg/mL de coloração nuclear de Hoechst (pelo menos 30 μL/gota) por 30 minutos em RT.
    NOTA: Um meio de montagem suplementado com 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para contracoloração de núcleos pode ser usado alternativamente. Nesse caso, esta etapa e a etapa 1.16 são ignoradas, prosseguindo diretamente para a etapa 1.17.
16. Transfira as gotículas para uma placa de 12 poços contendo 2 mL de PBS/poço usando uma espátula de borda arredondada e enxágue três vezes com PBS.
17. Monte as gotículas na lâmina do microscópio da seguinte forma:
    1. Aplique uma camada estreita de meio de montagem de endurecimento rápido nas bordas de uma lamínula quadrada de 22 mm x 22 mm e deixe secar por ~1 minuto. Execute esta etapa para cada gota individualmente, para evitar o endurecimento excessivo do meio de montagem.
       NOTA: Execute esta etapa na capela de exaustão, pois o meio de montagem de endurecimento rápido é perigoso para a saúde.
    2. Enxágue a gota mergulhando em um poço de uma placa de 12 poços contendo 2 mL de água deionizada e transfira para uma lâmina de microscópio, usando uma espátula de borda arredondada. Remova o excesso de água usando um pequeno pedaço de papel absorvente.
    3. Dispense 15 μL de meio de montagem antidesbotamento não endurecedor na gota.
       NOTA: Alternativamente, se a coloração nuclear de Hoechst não tiver sido usada, pode ser usado meio de montagem contendo 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI).
    4. Posicione suavemente a tampa de vidro, com o meio de montagem de endurecimento rápido voltado para a lâmina microscópica, sobre a gota e deixe assentar.
       NOTA: O meio de endurecimento rápido grudará na lâmina microscópica e manterá a gota no lugar.
18. Repita a etapa 1.17 para todas as gotículas. Monte duas gotículas em cada lâmina do microscópio.
19. Deixe as lâminas secarem ao ar em RT durante ~2 h e guarde a 4 °C durante a noite. Certifique-se de que os slides estejam posicionados horizontalmente e protegidos da luz.
20. Image as culturas FT ex vivo nativas ou de ponto final coradas usando um microscópio confocal ou um microscópio de epifluorescência vertical equipado com uma função de seccionamento óptico e objetiva de 20x ou 40x. Use a função de ladrilho para capturar uma área maior do tecido de uma só vez.

Materiais

< classe de figura='tabela' estilo='largura::' 693pt;'>td style='width:160pt;'>15727582 finalEstilo MilliporeGF346Millipore

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Material
Placas de cultura de células, 96-well, U-bottom	Greiner Bio-One	392-0019	Used for whole-mount immunofluorescence
Round/Flat Spatulas, Stainless Steel	VWR	82027-528	Used for whole-mount immunofluorescence
Coverslips 22x22mm #1	Menzel/Fisher<	Used for mounting
Microscope slides	Fisher	Kindler K102	Used for mounting
Absorbent paper	VWR	115-0202	Usado para montagem
PBS tablets	Medicago	09-9400-100	Used preparing 1x PBS
Acetona	Sigma-Aldrich	32201-2.5L-M	Usado para preparar a solução de pós-fixação. PREJUDICIAL: use luvas e/ou roupas de proteção. Utilização em hotte.
Methanol	Sigma-Aldrich	32213	Usado para preparar a solução de pós-fixação. TÓXICO: use luvas e/ou roupas de proteção. Utilização em hotte.
Triton X-100 (etoxilato de octilfenol)	Sigma-Aldrich	T9284	Used for whole-mount immunofluorescence. PREJUDICIAL: use luvas e/ou roupas de proteção.
Hoechst 33342, 20mM	Life Technologies	62249	Para contracoloração de núcleos. PREJUDICIAL: use luvas e/ou roupas de proteção e proteção para os olhos e/ou rosto.
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Use luvas e/ou roupas de proteção e proteção para os olhos. Utilização em hotte.
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200	Meio de montagem com contracoloração de núcleos. Use luvas e/ou roupas de proteção e proteção para os olhos. Utilização em hotte.
Eukitt Meio de montagem de endurecimento rápido	Sigma-Aldrich	03989-100ml	TOXIC: Use luvas e/ou roupas de proteção e proteção para os olhos. Utilização em hotte.
Recombinante humano VEGFA	R&D Systems	293-VE-010	50 ng/mL de concentração
Recombinant human VEGFC	R&D Systems	752-VC-025	200 ng/mL de concentração final
Estilo humano recombinante TGFβ	1 ng/ mL concentração
Estilo humano recombinante bFGF	01-106	50 ng/mL de concentração
CD31 (JC70A)	Dako	M0823	Usado na diluição 1:100, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD34 (QBEND10)	Dako	M716501-2	Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD45 (2B11+PD7/26)	Dako	M070129-2	Usado na diluição 1:100, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD68	ImmunoWay	RLM3161	Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
Cleaved caspase-3 (5A1E)	Cell Signalling	9664	Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
ERG (EP111)	Dako	M731429-2	Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
GFAP	Dako	Z0334	Usado na diluição 1:100, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Ki67	Leica Microsystems	NCL-Ki67p	Used at 1:1500 diluição, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Lyve1	R&D Systems	AF2089	Usado na diluição 1:100, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab
NG2	Millipore	AB5320	Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Prox1	ReliaTech	102-PA32	Usado na diluição 1:200, Goat anti Rabbit Alexa 568 Secondary Ab
Prox1	R&D Systems	AF2727	Used na diluição 1:40, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab
VEGFR3 (9D9F9)	Millipore	MAB3757	Usado na diluição 1:100, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
α-SMA (1A4)	Sigma	C6198	Used na diluição 1:400, Cy3 conjugado
Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG	Life Technologies	A-21202	Usado em diluição
Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG	Invitrogen	A-11012	Usado em 1:500 dilution
Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgG	Thermo Scientific	A-11057	Usado na diluição 1:500
Alexa Fluor568 Goat anti-Rabbit IgG	Thermo Scientific	A-11036	Used at 1:500 dilution	Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgG	Molecular Probes
A-21468	Usado na diluição 1:500
Name	Company	Número de catálogo	Comentários	Microscópios				Microscópio de epifluorescência invertida Axiovert 200	Zeiss		Para imagens do FT
AxioImager.Z1 microscópio de epifluorescência vertical com Apotome	Zeiss		Para imagens de FT imunocorado de montagem inteira

final final 1:500