Imunocoloração de neurônios em fatias de cérebro de camundongo após hibridização in situ fluorescente

Fonte: Baleriola, J., et. al., Detecção de mRNAs localizados axonalmente em seções cerebrais usando hibridização in situ de alta resolução. J. Vis. Exp. (2015)

Este vídeo demonstra a detecção de mRNA dentro de axônios colinérgicos em fatias fixas de hipocampo de camundongo usando hibridização in situ fluorescente e coloração de anticorpos. A microscopia de fluorescência revela a localização espacial de mRNAs marcados com sonda e colina acetiltransferase em neurônios colinérgicos.

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

FISH ensaio seguido de imuno-histoquímica usando antigénio/RNA induzido por calor/desmascaramento de RNA
1. Antes de começar, prepare todo o material necessário:
  1. Aqueça o forno de hibridização a 40 °C e coloque uma bandeja contendo água destilada no forno para criar um ambiente umidificado.
  2. Pegue uma caixa de slides e coloque toalhas de papel embebidas em água destilada dentro para umedecê-la. Em seguida, coloque a caixa deslizante no forno de hibridização.
  3. Remova as sondas (negativas e alvo) da geladeira e aqueça-as no forno de hibridização por 10 minutos. Em seguida, deixe as sondas esfriarem em RT.
  4. Equilibrate amplification reagents AMP 1-4 (incluído no Kit de Reagentes Multiplex Fluorescentes) em RT.
  5. Prepare a solução de recuperação de antígeno: 10 mM de citrato de sódio (pH 6), 0,05% Tween 20. Nota: A solução pode ser armazenada em RT indefinidamente e ser usada para coloração futura.
  6. Prepare 1x tampão de lavagem diluindo a solução estoque 50x (no Kit de Reagentes Multiplex Fluorescentes) em água sem RNase ou tratada com DEPC.
    NOTA: 1x tampão de lavagem pode ser armazenado no RT por 1 mês e ser usado para coloração futura. 50x tampão de lavagem pode precipitar. Nesse caso, aqueça o tampão de lavagem 50x a 40 °C por 10 min antes de preparar a solução 1x.
2. Remova as lâminas do etanol 100% e seque ao ar por 5 min em RT.
3. Prepare um frasco de coplin contendo 50 ml de solução de recuperação de antígeno. Mergulhe as lâminas em solução de recuperação de antígeno e ferva-as por 10 min em um forno de micro-ondas.
  NOTA: Em alternativa, coloque as lâminas horizontalmente num prato de vidro redondo de 100 mm de diâmetro contendo 100 ml de solução de recuperação.
  1. Encha um copo de 1 L com água destilada e coloque-o no micro-ondas.
    NOTA: A água irá "amortecer" o calor ao realizar o desmascaramento.
  2. Coloque as lâminas na solução de recuperação de antígeno dentro do micro-ondas. Ferva as lâminas em alta potência por 5 min. Imediatamente após as amostras pararem de ferver, o calor desliza novamente em alta potência por mais 5 minutos.
  3. Resfrie os slides em RT.
    NOTA: ETAPA CRÍTICA: a duração e o procedimento de fervura devem ser determinados pelo usuário, dependendo das características do micro-ondas. Quanto mais rápido a fervura começar, maiores serão as chances de evaporação da solução. Neste caso, recomenda-se que as amostras sejam fervidas por períodos de tempo mais curtos, mais de duas vezes, para completar um tempo total de desmascaramento de 10 min. Pelo contrário, se o aquecimento for realizado em potência média ou baixa, o desmascaramento pode ser realizado uma vez por 10 min. No entanto, se as amostras não ferverem continuamente por um total de aproximadamente 10 minutos, isso pode resultar no desmascaramento parcial do RNA alvo e da proteína a ser detectada.
4. Lave as lâminas três vezes com 1x PBS.
5. Adicione 2 - 3 gotas (~100 μl) do conjunto de sondas dapB às fatias cerebrais usadas para avaliar a coloração de fundo. NOTA: O conjunto de sondas dapB tem como alvo um gene bacteriano e não deve reconhecer nenhum RNA de mamíferos.
6. Adicione 2 a 3 gotas do conjunto de sondas de direcionamento às fatias cerebrais usadas para detectar o RNA de interesse. NOTA: um conjunto de sondas direcionada aos resíduos 20 a 1.381 do mRNA Atf4 do camundongo é usado neste exemplo.
7. Cubra as lâminas com parafilme para evitar a evaporação da sonda, coloque-as na caixa de lâminas umidificadas dentro do forno de hibridização e incube-as a 40 °C por 2 horas.
  NOTA: OPCIONAL: fatias cerebrais adicionais podem ser hibridizadas com um conjunto de sondas direcionadas ao mouse Polr2A e usadas como controles positivos.
8. Lave as lâminas duas vezes com 1x tampão de lavagem por 2 min em RT.
9. Adicione 2 - 3 gotas de reagente de amplificação AMP 1-FL a cada fatia de cérebro, cubra as lâminas com parafilme, coloque-as na caixa de lâminas e incube a 40 °C por 30 min no forno de hibridização.
10. Lave as lâminas duas vezes com 1x tampão de lavagem por 2 min em RT.
11. Adicione 2 - 3 gotas de reagente de amplificação AMP 2-FL a cada fatia de cérebro, cubra as lâminas com parafilme, coloque-as na caixa de lâminas e incube a 40 °C por 15 min no forno de hibridização.
12. Lave as lâminas duas vezes com 1x tampão de lavagem por 2 min em RT.
13. Adicione 2 - 3 gotas de reagente de amplificação AMP 3-FL a cada fatia de cérebro, cubra as lâminas com parafilme, coloque-as na caixa de lâminas e incube a 40 °C por 30 min no forno de hibridização.
14. Lave as lâminas duas vezes com 1x tampão de lavagem por 2 min em RT.
15. Adicione 2 - 3 gotas de reagente de amplificação AMP 4-FL a cada fatia de cérebro, cubra as lâminas com parafilme, coloque-as na caixa de lâminas e incube a 40 °C por 15 min no forno de hibridização.
16. Lave as lâminas duas vezes com 1x tampão de lavagem por 2 min em RT e duas vezes com 1x PBS.
17. Adicione 100 - 200 μl (ou volume suficiente para cobrir completamente as fatias) de uma solução de bloqueio contendo 3 mg/ml de BSA, 100 mM de glicina e 0,25% de Triton X-100 em PBS (pH 7,4) às lâminas, cubra-as com parafilme e incube por 30 min em RT.
18. Adicionar 100 - 200 μl de anticorpo anti-ChAT diluído em solução de bloqueio (1/100) às lâminas, cobri-las com parafilme e incubar durante 2 dias a 4 °C. Certifique-se de que as fatias do cérebro não sequem. Se necessário, reaplique a solução de anticorpo anti-ChAT em fatias de cérebro 24 horas após a incubação.
19. Lave as lâminas três vezes em 1x PBS por 5 min em RT.
20. Adicione 100 - 200 μl do anticorpo secundário conjugado com Alexa apropriado (por exemplo, anti-cabra de burro Alexa-594 para este exemplo específico) às lâminas, cubra com parafilme e incube por 1 hora em RT.
21. Lave as lâminas três vezes em 1x PBS por 5 min em RT.
22. Lave as lâminas uma vez com água destilada.
23. Monte slides com um meio de montagem contendo DAPI.
24. Visualize fatias de cérebro sob um microscópio de fluorescência.

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sonda personalizada direcionada aos resíduos 20-1381 do mRNA Atf4 do camundongo (NM_009716)	Advanced Cell Diagnostics	-	Probe
Sonda personalizada direcionada aos resíduos 15-1256 do mRNA ATF4 humano (NM_001675.2)	Advanced Cell Diagnostics	-	Probe
Sonda de controle negativo-DapB	Advanced Cell Diagnostics	310043	Probe
Positive control probe-mouse Polr2A (opcional)	Advanced Cell Diagnostics	312471	Probe
Goat polyclonal anti-ChAT	Millipore	AB144P
Meio de montagem ProLong Gold com DAPI	Life Technologies	P36935
RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit (para detecção de fluorescência)	Advanced Cell Diagnostics	320850	Kit de hibridização in situ

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