Imagens de alta resolução de receptores de neurotransmissores em sinapses retinianas

Resumo

Fonte: Zhang, J., et al. Análise Quantitativa de Alta Resolução de Imunoouro de Receptores de Membrana em Sinapses de Fita Retiniana. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra uma técnica de microscopia eletrônica para visualizar a localização do receptor de neurotransmissor nas sinapses da retina. As seções da retina contêm células ganglionares da retina que exibem receptores de neurotransmissores ligados à membrana e são marcadas com a subunidade B da toxina da cólera (CTB). Ao marcar os marcadores com anticorpos conjugados com nanopartículas de ouro e contra-corar a seção com metais pesados, os receptores RGC são visualizados ao microscópio.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Fixação de tecido retiniano

Monte os seguintes materiais e ferramentas: Um microscópio de dissecação, 2 pinças com pontas muito finas, tesoura, papel de filtro de celulose, pipeta de plástico e uma lâmina de microscópio.

2. Anestesiar o rato em uma câmara fechada com 2,0 ml de halotano (um anestésico inalante). Determine a anestesia adequada por estes métodos: falta de retirada da pata traseira após beliscar o dedo do pé ou falta de reflexo de piscar. Em seguida, decapite imediatamente com guilhotina. Remova os olhos com uma tesoura de íris e coloque em um prato de vidro contendo 4% de paraformaldeído em tampão fosfato 0,1 M (PB) a pH 7,4.
3. Usando o microscópio de dissecação, remova a córnea cortando a frente do globo ocular. Remova o cristalino e o vítreo da superfície interna da retina com uma pinça.
4. Descasque a esclera com as duas pinças até que a retina seja isolada da ocular.
5. Corte a retina imediatamente em tiras de 100 a 200 μm de espessura com uma navalha e submeta à fixação de deslocamento de pH.
6. Fixe as tiras de retina em paraformaldeído a 4% em PB 0,1 M em pH 6,0 por 20 a 30 min e depois em paraformaldeído a 4% mais glutaraldeído a 0,01% em pH 10,5 por 10 a 20 min em temperatura ambiente (RT).
7. Após várias lavagens em PB com 0,15 mM CaCl₂ (pH 7,4 a 4°C), crioproteja as tiras retinianas com glicerol (60 min cada em 10%, 20%, 30% e depois durante a noite [O/N] em 30%) em 0,1 M PB antes da substituição por congelamento.

2. Freeze-substitution

NOTA: Este método de congelamento de substituição é modificado a partir de um protocolo publicado anteriormente. Além disso, é fundamental que os instrumentos estejam muito frios (use luvas); caso contrário, o tecido pode descongelar parcialmente quando tocado com os instrumentos. Todas essas etapas são feitas dentro da câmara de substituição automática por congelamento (AFS) e os instrumentos nunca podem se mover acima da borda da câmara. Da mesma forma, é necessário o resfriamento adequado de todos os produtos químicos usados no AFS.

1. Mergulhe e congele as tiras de retina em propano líquido a -184°C em um instrumento de criopreservação (CPC) de microscópio eletrônico (EM). Usando um pincel fino, coloque as amostras em pequenos pedaços de fita adesiva dupla presos aos tocos de metal que ficam na extremidade das hastes de mergulho (retire o tampão extra usando o pincel).
2. Mergulhe as hastes no propano líquido e mantenha-as lá por cerca de 5 segundos e, em seguida, transfira para o instrumento automático de substituição por congelamento (AFS) usando uma pequena câmara de transporte preenchida com nitrogênio líquido (recipiente de transferência criogênica resfriado LN₂).
3. Depois de colocar a amostra congelada e os instrumentos (fórceps e bisturi) no AFS, resfrie os instrumentos na câmara por vários minutos antes de tocar no tecido ou resfrie-os colocando as pontas dos instrumentos por alguns segundos na pequena câmara de transporte (cheia de nitrogênio líquido (recipiente de criotransferência resfriado LN₂)).
4. Uma vez no AFS, remova a amostra e a fita do stub usando um bisturi fino. Além disso, mantenha o controle de fluxo de gás nitrogênio, TF (TF é descrito como um 'controle regulador para vaporizador LN₂') aberto durante esses procedimentos.
5. Antes de colocar o tecido congelado nos suportes de incorporação plana (ou seja, antes de configurar o AFS), corte um círculo fino de uma folha de plástico transparente e coloque-o na parte inferior do suporte para forrar o fundo de cada poço. Isso permite uma remoção relativamente mais fácil dos blocos de amostra polimerizados quando terminados.
   NOTA: Anteriormente, usamos um método alternativo aos suportes de incorporação plana e empregamos cápsulas duplas de Reichert+gelatina.
6. Use a seguinte sequência automática no AFS (usando a terminologia do instrumento): T1 = -90°C por 32 horas, S1 = aumentar a temperatura em 4°C/h (11,3 horas), T2 = -45°C por 50 horas, S2 = aumentar a temperatura em 5°C/h (9 horas), T3 = 0°C por 40 horas (total = 142,3 horas). Pode levar de 2 a 4 horas para colocar as amostras no AFS (a -90 ° C) antes de iniciar a sequência cronometrada.
7. Mergulhe as seções congeladas em acetato de uranila a 1,5% em metanol a -90°C por >32 horas no AFS. Coloque dois pedaços de tecido (normalmente) em cada um dos sete poços no suporte de alumínio embutido (três se encaixam no AFS).
   1. Coloque o tecido+fita no acetato de uranila/metanol nos poços e remova a fita mais tarde, pouco antes de iniciar a infiltração do meio de incorporação (como Lowicryl HM20), se for muito difícil remover o tecido da fita.
8. Em seguida, aumente a temperatura passo a passo para -45°C (+4°C por hora; na sequência automática).
9. Lave as amostras três vezes em metanol pré-resfriado, usando uma pipeta de plástico de ponta fina para remover a solução antiga de cada suporte de incorporação plana e, em seguida, usando outra pipeta de plástico padrão para adicionar o metanol fresco pré-resfriado.
10. Em seguida, usando o mesmo método, infiltre as amostras progressivamente com resinas de inclusão de baixa temperatura, como meio de incorporação (HM20/metanol a 1:1 e 2:1, cada um por 2 horas, seguido de resina pura por 2 horas e, em seguida, troque as resinas e mantenha O/N).
11. Troque a resina novamente no dia seguinte, ajustando o nível da resina para chegar apenas à borda superior dos poços.
12. Polimerize as amostras (-45°C a 0°C em sequência automática; +5°C por hora) com luz ultravioleta (UV) por 40 horas.
13. Em seguida, remova as amostras do AFS. Normalmente, os blocos de amostra ainda mostram alguma cor rosada. Colocar as amostras perto da luz fluorescente na hotte química, a RT O/N ou mais até parecerem completamente límpidas.

3. Postembedding EM Immunogold Immunocytochemistry

1. Corte seções de 1 μm com ultramicrótomo, core as seções com 1% de toluidina-azul e examine-as quanto à orientação da seção; oriente o bloco de tecido para atingir o plano transversal ideal de seccionamento.
2. Corte seções ultrafinas de 70 nm de espessura com ultramicrótomo e colete-as em grades de níquel revestidas de carbono Formvar.
3. Lave as grades uma vez em H₂O destilado seguido por uma solução salina tamponada com Tris três vezes (TBS, tampão Tris 0,05 M, NaCl 0,7%, pH 7,6) lavagem.
4. Incube grades em gotas de 20 μl de albumina de soro bovino (BSA) a 5% em TBS por 30 min e, em seguida, em gotas de 20 μl de uma mistura contendo subunidade B de toxina anticólera de cabra (anti-CTB, 1:3.000) e um anticorpo para uma subunidade do receptor N-metil-D-aspartato (NMDAR) (subunidade NMDAR glutamatérgica anti-coelho A [GluN2A] 1:50, GluN2B 1:30) ou um GluA2/3 anti-coelho (ácido heterotetramético α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropiônico [AMPA], 1:30) em TBS-Triton (TBST, 0,01% Triton X-100, pH 7,6) com 2% de BSA e 0,02 M NaN₃ O/N em RT.
5. Lave as grades em três gotas separadas (20 μl) de TBS (pH 7,6) por 10, 10 e 20 min, seguidas de TBS (pH 8,2) por 5 min.
6. Incube grades por 2 horas em gotas (20 μl) de uma mistura contendo imunoglobulina G anti-coelho de burro (IgG, 1:20) acoplada a partículas de ouro de 10 nm e IgG anti-cabra de burro (1:20) acoplada a partículas de ouro de 18 nm em TBST (pH 8,2) com 2% de BSA e 0,02 M NaN₃.
7. Lave as grades em gotas de 20 μl de TBS (pH 7,6) por 5, 5 e 10 min, depois em água ultrapura e seque-as.
8. Contra-manchas com 5% de acetato de uranila e 0,3% de citrato de chumbo em H₂O destilado por 8 e 5 min em condições escuras, respectivamente.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Paraformaldeído	EMS	15710
Glutarldeído	EMS	16019
NaH2PO4	Sigma	S9638
Na2HPO4	Sigma	7782-85-6
CaCl2	Sigma	C-8106
BSA	Sigma	A-7030
Triton X-100	Sigma	T-8787
NaOH	Sigma	221465
NaN3	JT Baker	V015-05
Glycerol	Gibco BRL	15514-011
Lowicryl HM 20	Polysciences	15924-1
Tris-Base	Fisher	BP151-500
Tris	Fisher	04997-100
Anti-GluN2A	Millipore	AB1555P	Diluição 1/50
Anti-GluN2B	Millipore		AB1557P Diluição 1/30
Anti-GluA2/3	Millipore	AB1506	Diluição 1/30
Anti-PSD-95	Millipore	MA1–046	Diluição 1/100
Donkey anti-rabbit IgG-10 nm partículas de ouro	EMS	25704	Diluição 1/20
Donkey anti-mouse IgG-10 nm partículas de ouro	EMS	25814	Diluição 1/20
Donkey anti-mouse IgG-5 nm partículas de ouro	EMS	25812	Diluição 1/20
Donkey anti-goat IgG-18 nm partículas de ouro	Jackson ImmunoResearch	705-215-147	Diluição 1/20
Formvar-Carbon revestido de níquel-slot grades.	EMS	FCF2010-Ni
Acetato de uranilo	EMS	22400-1
Metanol	EMS	67-56-1
Citrato de chumbo	Leica
Leica EM AFS	Leica
Leica EM CPC	Leica
Ultromicrótomo	Leica
JEOL 1200 EM	JEOL
liquid nitrogen	Roberts Oxygen
Propano	Roberts Oxygen
CTB	List Biological Laboratories	104	1-1.2%
Anti-CTB	List Biological Laboratories	703	Diluição 1/4000