Monitoramento em tempo real da ativação do receptor de odor em células recombinantes

Resumo

Fonte: de March, C. A. et. al., Monitoramento in vitro em tempo real da ativação do receptor de odor por um odorante na fase de vapor. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra o método para monitorar a ativação em tempo real de receptores de odor em células recombinantes de mamíferos usando medição de luminescência. A ligação ao odorante desencadeia a ativação da proteína G e a produção de cAMP, ativando proteínas glosensor que emitem luminescência após a ligação ao substrato, fornecendo uma medida quantitativa da resposta do receptor.

Protocolo

1. Cultura

1. de células Hana3APrepare M10 (Minimum Essential Medium (MEM) mais 10% v/v de soro fetal bovino (FBS)) e M10PSF (M10 mais 100 μg/mL de penicilina-estreptomicina e 1,25 μg/mL de anfotericina B).
2. Cultive as células em 10 mL de M10PSF em uma placa de cultura de células de 100 mm em uma incubadora ajustada a 37 °C e 5% de dióxido de carbono (CO2).
3. Divida as células a cada 2 dias em uma proporção de 20%: quando 100% de confluência de células (aproximadamente 1,1 x 10⁷ células) for observada em um microscópio de contraste de fase, aspire o meio e lave as células suavemente com 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
4. Aspire PBS e adicione 3 mL de ácido tripsina-etilenodiamina tetracético a 0,05% (EDTA, 0,48 mM). Deixe agir por aproximadamente 1 minuto, até que as células se dissociem da placa.
5. Adicione 5 mL de M10 para inativar a tripsina e, eventualmente, separar as células ainda presas à placa pipetando para cima e para baixo.
6. Transfira o volume (8 mL) para um tubo de 15 mL e centrifugue a 200 x g por 5 min. Aspire o sobrenadante e ressuspenda as células em 5 mL de M10PSF pipetando para cima e para baixo para quebrar qualquer massa celular. Evite criar bolhas no tubo.
7. Transferir 1 ml da solução de células ressuspensas para uma nova placa de cultura de células de 100 mm e adicionar 9 ml de M10PSF fresco. Incubar a 37 °C e 5% de CO₂.

2. Preparação das células para transfecção

1. Avalie a confluência, ou o número de células, observando-as sob um microscópio de contraste de fase. Pelo menos 10% de confluência (aproximadamente 1,1 x 10⁶ células) é necessária para uma placa.
2. Aspire o meio e lave as células suavemente com 10 mL de PBS. Aspire PBS e adicione 3 mL de EDTA. Deixe agir por aproximadamente 1 min em temperatura ambiente, até que as células se dissociem da placa.
3. Adicione 5 mL de M10 para inativar a tripsina e, eventualmente, separar as células ainda presas à placa pipetando para cima e para baixo. Transfira o volume (8 mL) para um tubo de 15 mL e centrifugue a 200 x g por 5 min.
4. Aspire o sobrenadante e ressuspenda as células em 5 mL de M10PSF pipetando para cima e para baixo para quebrar qualquer massa celular. Evite criar bolhas no tubo.
5. Dependendo do número de placas a serem transfectadas, transfira uma quantidade apropriada de células em um reservatório com o volume correspondente adequado de M10PSF. Uma placa de 96 poços deve ser plaqueada com 1/10 de uma placa 100% confluente de 100 mm (aproximadamente 1,1 x 10⁶ células) diluída em M10PSF para atingir um volume total de 6 mL. Para uma placa de 96 poços começando com uma placa de 100 mm de confluência de 100%, adicione 500 μL de 5 mL de células ressuspensas a 5,5 mL de M10PSF fresco. Misture as células e o M10PSF sem gerar bolhas de ar.
6. Pipete 50 μL das células suspensas em cada poço da placa de 96 poços usando uma pipeta multicanal. Incubar durante a noite a 37 °C e 5 % de CO₂.

3. Transfecção

1. de plasmídeoObserve a placa de 96 poços sob um microscópio de contraste de fase para garantir uma confluência celular entre 30% e 50%.
2. Prepare uma primeira mistura de transfecção que contenha os plasmídeos comuns a toda a placa (uma versão mais curta da proteína transportadora de receptor 1 (RTP1S), receptor de odor (OR) e proteína Glosensor; ver Tabela de Materiais) seguindo os volumes da Tabela 1. Observe que a quantidade de OR marcada com Rho deve ser dividida pelo número de ORs se vários ORs.
   NOTA: Recomendamos fortemente adicionar um controle negativo de vetor vazio (aqui Rho-pCI) e qualquer controle positivo (OU conhecido por responder ao odorante testado) ao plano de experimento.
3. Prepare uma segunda mistura de transfecção contendo 500 μL de MEM e 20 μL de reagente de lipofectamina 2000 (válido para uma placa de 96 poços, consulte a Tabela de Materiais). Adicione a segunda mistura à primeira e misture delicadamente pipetando para cima e para baixo e incube por 15 min em temperatura ambiente. Adicione 5 mL de M10 e misture delicadamente.
4. Substitua o M10PSF na placa de 96 poços previamente chapeada por 50 μL do meio de transfecção final. Incubar numa incubadora regulada para 37 °C e 5% de CO₂ e aspirar a câmara do luminómetro durante a noite.

4. Incubação de substrato

1. Observe a placa de 96 poços sob um microscópio de contraste de fase para garantir uma confluência celular entre 60% e 100%. Preparar uma solução de simulação da solução salina equilibrada de Hank (HBSS) contendo 10 mM de ácido hidroxietilpiperazineetanossulfónico (HEPES) e 5 mM de D-glicose.
2. Diluir 75 μL da solução de reagente de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) (ver Tabela de Materiais) para 2,75 mL da solução de estimulação. Remova o meio de transfecção da placa de 96 poços e lave as células adicionando 50 μL de solução de estimulação fresca a cada poço.
3. Remova a solução de estimulação e adicione 25 μL de solução reagente de cAMP preparada na etapa 4.2 a cada poço. Incube a placa de 96 poços em temperatura ambiente em um ambiente escuro e sem odor (por exemplo, uma gaveta vazia limpa longe de produtos químicos ou qualquer fonte de odor) por 2 h.

5. Estimulação de odor

1. Primeiro, equilibre a câmara do luminômetro com moléculas de odor voláteis. Diluir o odor até a concentração desejada em 10 mL de óleo mineral (Figura 1A). Antes do final do tempo de incubação do reagente cAMP, adicione 25 μL da solução odorífera a uma nova placa de 96 poços (não àquela que contém as células). Incube esta placa odorífera à temperatura ambiente na câmara do luminômetro por 5 min (Figura 1B) (nenhuma gravação do luminômetro é necessária aqui).
2. Defina o luminômetro para registrar a luminescência com 0 s de atraso durante 20 ciclos de medição de placa de 90 s com 0.7 s de intervalo entre os ciclos.
3. Logo antes de ler a placa, remova a placa de odor da câmara. Adicione 25 μL de odor entre os poços da placa de 96 poços contendo as células (não adicione o odorante nos poços que contêm as células) e inicie rapidamente a medição de luminescência de todos os poços por 20 ciclos em 30 minutos (Figura 1C).

Tabela 1: Misture para transfecção. Quantidades de plasmídeos (proteína Glosensor, RTP1S e OR) para adicionar ao MEM para transfectar em uma placa de 96 poços.

	Por placa de 96 poços
MEM	500 μL
pGlosensor	10 ng
RTP1S	5 ng
OR	75 ng

 

Resultados

Figura 1: Protocolos esquemáticos para monitoramento em tempo real da ativação do receptor de odorante por odorante vaporizado. O odorante (violeta) foi diluído na concentração de...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0.05% trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	0,05% Tripsina - EDTA (1x), vermelho de fenol - armazenar a 4 °
100 mm placa de cultura de células	BD Falcon	353003	100 mm x 20 mm cell culture dish
15 mL tube	BD Falcon	352099	17 mm x 120 mm tubos cônicos
96-well plate	Corning	3843	96 bem, com tampa LE branca com fundo transparente Poliestireno revestido de poli-D-lisina
Anfotericina	Gibco	15290-018	Anfotericina B 250 μg/mL - armazenar a 4 °C
Centrifuge machine	Jouan	C312	Máquina centrífuga com rotor de balde oscilante para 15 mL
Class II Type A/B3 exaustor	NUAIRE	NU-407-500	Fumehood para cultura
FBS	Gibco	16000-044	Fetal Bovine Serum - armazene a -20 °
GloSensor cAMP Reagent	Promega	E1290	GloSensor cAMP Reagent substrato de proteína luminescente - armazenar a -20 °
Incubadora 37 °C; 5% de dióxido de carbono	Fisher Scientific	11-676-604	Incubadora para cultura
Lipofectamine 2000 reagent	Invitrogen	11668-019	Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml reagente de transfecção - armazenar a 4 ° C
Luminometer POLARstar OPTIMA	BMG LABTECH	discontinued	96 leitor de placas de poço para luminescência
Mineral oil	Sigma	M8410	Solvente para odores - armazene em temperatura ambiente
Minimum Essential Medium (MEM)	Corning cellgro	10-010-CV	Minimum Essential Medium Eagle com sais de Earle e L-glutamina - armazenar a 4 °C
Penicilina/Streptomycin<	P4333	Solução de penicilina-estreptomicina estabilizada com 10.000 U de penicilina e 10 mg de estreptomicina - armazene a -20 ° C
Promega	pGloSensor-22F cAMP plasmídeo de proteína luminescente - armazenar a 4 ° C
090-131.001
H. Matsunami lab	-	100 ng/μL plasmídeo -

C de célulasCCde célulastd style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;text-align:center;vertical-align:top;'>Sigma Aldrich < td style = 'background-color: #ffffff; padding: 0px 3px; vertical-align: top;'>pGlosensor < td style = 'background-color: #ffffff; padding: 0px 3px; text-align: center; vertical-align: top; '>E2301 < td style = 'background-color: #ffffff; preenchimento: 0px 3px; alinhamento vertical: superior; '> microscópio de contraste de fase< estilo td = 'cor de fundo: #ffffff; preenchimento: 0px 3px; alinhamento de texto: centro; alinhamento vertical: superior; '> Leica < estilo td = 'cor de fundo: #ffffff; preenchimento: 0px 3px; alinhamento vertical: topo;' >Microscópio de contraste de fase com objetivas x4, x10, x20<td style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>RTP1S armazenar a 4°C