Monitoramento em tempo real da ativação do receptor de odor em células recombinantes

Resumo

Fonte: de March, C. A. et. al., Monitoramento in vitro em tempo real da ativação do receptor de odor por um odorante na fase de vapor. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra o método para monitorar a ativação em tempo real de receptores de odor em células recombinantes de mamíferos usando medição de luminescência. A ligação ao odorante desencadeia a ativação da proteína G e a produção de cAMP, ativando proteínas glosensor que emitem luminescência após a ligação ao substrato, fornecendo uma medida quantitativa da resposta do receptor.

Protocolo

1. Cultura

1. de células Hana3APrepare M10 (Minimum Essential Medium (MEM) mais 10% v/v de soro fetal bovino (FBS)) e M10PSF (M10 mais 100 μg/mL de penicilina-estreptomicina e 1,25 μg/mL de anfotericina B).
2. Cultive as células em 10 mL de M10PSF em uma placa de cultura de células de 100 mm em uma incubadora ajustada a 37 °C e 5% de dióxido de carbono (CO2).
3. Divida as célul....

Resultados

Figura 1: Protocolos esquemáticos para monitoramento em tempo real da ativação do receptor de odorante por odorante vaporizado. O odorante (violeta) foi diluído na concentração de.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0.05% trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	0,05% Tripsina - EDTA (1x), vermelho de fenol - armazenar a 4 °
100 mm placa de cultura de células	BD Falcon	353003	100 mm x 20 mm cell culture dish
15 mL tube	BD Falcon	352099	17 mm x 120 mm tubos cônicos
96-well plate	Corning	3843	96 bem, com tampa LE branca com fundo transparente Poliestireno revestido de poli-D-lisina
Anfotericina	Gibco	15290-018	Anfotericina B 250 μg/mL - armazenar a 4 °C
Centrifuge machine	Jouan	C312	Máquina centrífuga com rotor de balde oscilante para 15 mL
Class II Type A/B3 exaustor	NUAIRE	NU-407-500	Fumehood para cultura
FBS	Gibco	16000-044	Fetal Bovine Serum - armazene a -20 °
GloSensor cAMP Reagent	Promega	E1290	GloSensor cAMP Reagent substrato de proteína luminescente - armazenar a -20 °
Incubadora 37 °C; 5% de dióxido de carbono	Fisher Scientific	11-676-604	Incubadora para cultura
Lipofectamine 2000 reagent	Invitrogen	11668-019	Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml reagente de transfecção - armazenar a 4 ° C
Luminometer POLARstar OPTIMA	BMG LABTECH	discontinued	96 leitor de placas de poço para luminescência
Mineral oil	Sigma	M8410	Solvente para odores - armazene em temperatura ambiente
Minimum Essential Medium (MEM)	Corning cellgro	10-010-CV	Minimum Essential Medium Eagle com sais de Earle e L-glutamina - armazenar a 4 °C
Penicilina/Streptomycin<	P4333	Solução de penicilina-estreptomicina estabilizada com 10.000 U de penicilina e 10 mg de estreptomicina - armazene a -20 ° C
Promega	pGloSensor-22F cAMP plasmídeo de proteína luminescente - armazenar a 4 ° C
090-131.001
H. Matsunami lab	-	100 ng/μL plasmídeo -

C de célulasCCde célulastd style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;text-align:center;vertical-align:top;'>Sigma Aldrich < td style = 'background-color: #ffffff; padding: 0px 3px; vertical-align: top;'>pGlosensor < td style = 'background-color: #ffffff; padding: 0px 3px; text-align: center; vertical-align: top; '>E2301 < td style = 'background-color: #ffffff; preenchimento: 0px 3px; alinhamento vertical: superior; '> microscópio de contraste de fase< estilo td = 'cor de fundo: #ffffff; preenchimento: 0px 3px; alinhamento de texto: centro; alinhamento vertical: superior; '> Leica < estilo td = 'cor de fundo: #ffffff; preenchimento: 0px 3px; alinhamento vertical: topo;' >Microscópio de contraste de fase com objetivas x4, x10, x20<td style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>RTP1S armazenar a 4°C