Induzindo a formação de coágulos sanguíneos no cérebro de camundongos usando um corante fotossensível

Resumo

Fonte: Talley Watts, L., et al. Fototrombose de Rosa Bengala por Imagem Óptica Confocal In Vivo: Um Modelo de AVC de Vaso Único. J. Vis. Exp. (2015)

Este vídeo demonstra uma técnica para induzir a formação de coágulos sanguíneos no cérebro de um camundongo. Um camundongo anestesiado com uma janela craniana e um crânio afinado sofre fototrombose através da ativação de um corante fotossensível usando luz de alta intensidade. Esse processo gera espécies reativas de oxigênio, que danificam as paredes dos vasos e desencadeiam a formação de coágulos, obstruindo o fluxo sanguíneo para o cérebro.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Anestesia para preparação cortical

1. Coloque o camundongo em uma câmara de indução com 2-3% de isofluorano misturado com oxigênio para induzir a anestesia. Observe a diminuição da taxa de respiração à medida que o camundongo é induzido. Aperte a pata do mouse para determinar se o mouse está pronto para se mover para o cone do nariz. Nota: O nível de anestesia é uma etapa crítica em qualquer preparação in vivo e deve-se tomar cuidado para não induzir um nível que cause isquemia global.
2. Assim que o camundongo estiver suficientemente anestesiado, transfira o animal para a plataforma de cirurgia/imagem e coloque o nariz do camundongo no cone do nariz e aplique 1-1,2% de isofluorano para manter um estado anestesiado. Certifique-se de que o mouse esteja deitado em uma almofada de aquecimento com temperatura controlada para manter a temperatura corporal (37 ° C +/- 0.5 ° C) durante os procedimentos restantes. Coloque pomada veterinária sobre os olhos para evitar o ressecamento durante a anestesia.
3. Monitore a fisiologia do mouse usando um sistema de oximetria de pulso usando o clipe de cauda ou pé fornecido com o sistema. Verifique se a frequência respiratória é mantida entre 50-65 respirações/min. Verifique se a frequência cardíaca permanece entre 300 a 450 bpm e a saturação de oxigênio é mantida entre 97-98% para garantir a sobrevivência a longo prazo do animal.
4. Quando o camundongo estiver adequadamente anestesiado, raspe o cabelo sobre o crânio usando uma tesoura elétrica, remova os pelos residuais e limpe com betadine, seguido de um cotonete com etanol. Repita este procedimento até três vezes para garantir um ambiente cirúrgico estéril.

2. Procedimento cirúrgico

1. Com o couro cabeludo totalmente limpo e raspado, faça uma incisão de 5 mm no couro cabeludo do camundongo para revelar as fissuras cranianas e localizar o bregma.
2. Use um aplicador de algodão estéril para remover qualquer fáscia remanescente que recobre o crânio.
3. Cole um anel de aço inoxidável feito sob medida (Figura 1) com adesivo de tecido no osso que cobre o córtex parietal usando as coordenadas estereotáxicas de Bregma: -1 a -3 mm e lateral: 2-4 mm. Nota: A cola normalmente endurece dentro de 2 minutos após a colocação do anel no osso.
4. Afixe o anel em um suporte estereotáxico (Figura 2) para estabilizar o mouse e evitar o movimento durante a geração de imagens.
5. Sob um microscópio de dissecação de grau cirúrgico, perfure lentamente uma seção de 1-2 mm no crânio usando uma ferramenta semelhante a dremel com velocidade controlada (broca Meisinger de 3,9 mm), certificando-se de manter a área nivelada à medida que é perfurada. Consiga isso usando um padrão em zigue-zague. Para evitar o acúmulo de calor, defina a velocidade da broca para baixa e faça pausas frequentes.
6. Quando o crânio craniano ficar com aparência brilhante, continue o afinamento do crânio usando uma lâmina de bisturi utilizando o mesmo padrão em zigue-zague para manter o nível da superfície mais fina para facilitar a remoção suave de camadas finas do crânio craniano. Usando a ponta da lâmina do bisturi, faça pequenos movimentos lineares com leve pressão para remover camadas finas de osso de cada vez. Continue até que a vasculatura seja claramente visível através do microscópio de dissecação.
7. Se o experimentador perfurar ou quebrar o crânio durante o processo de afinamento, sacrifique o animal devido a prováveis danos ao córtex subjacente.
   Nota: O crânio do camundongo tem aproximadamente 300 μm de espessura e é composto por duas camadas finas de osso compacto (uma camada externa e uma interna) e uma camada de osso esponjoso imprensada entre as duas camadas de osso compacto. A camada externa de osso compacto e a maior parte do osso esponjoso são removidas dentro da área de perfuração de 5 mm, resultando em uma camada de aproximadamente 50 μm de osso compacto remanescente (ver Figura 2B). A visualização da vasculatura garantirá que o crânio final afinado intacto tenha aproximadamente 50 μm de espessura. O crânio, portanto, ainda está presente quando afinado.

3. Configuração do microscópio

1. Use um sistema de microscópio invertido (sistemas convencionais, confocais ou de dois fótons) que tenha um inversor objetivo. Nota: Também é possível utilizar um microscópio vertical padrão. O fator limitante será o espaço entre o palco e os objetivos. Modificações no palco podem ser necessárias para realizar essa configuração.
2. Prenda a plataforma cirúrgica/de imagem a uma platina personalizada localizada ao lado da base do microscópio. Nota: A plataforma é feita usando um macaco de laboratório para permitir o movimento vertical da plataforma cirúrgica/de imagem sob a objetiva. O macaco de laboratório é montado em uma placa afixada em quatro pólos cilíndricos. (Veja Figura 2).
3. Posicione o inversor de objetiva contendo uma objetiva de 20X sobre a janela craniana. Use uma fonte de luz externa para encontrar a janela craniana olhando através das oculares do microscópio e posicione a objetiva na área de imagem. Nota: A área de imagem será indicada pela presença da vasculatura.
4. Para objetivos à base de água, use líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF) (130 mM de NaCl; 30 mM de KCl; 12 mM de KH₂PO₄; 200 mM de NaHCO₃; 30 mM de ácido hidroxietilpiperazina etano sulfônico [HEPES]; e 100 mM de glicose) como meio devido ao potencial vazamento para a cavidade craniana durante a imagem (Figura 3).

4. Preparação do corante Rosa Bengala, administração e indução de acidente vascular cerebral

1. Prepare uma solução fresca de 20 mg/ml de Rosa Bengala em aCSF; filtrar e esterilizar antes da administração. Não reutilize ou armazene a Rosa Bengala depois de misturada. Faça uma nova solução para cada experimento.
2. Administre uma injeção de 0,1 ml de Rose Bengal na veia da cauda enquanto escaneia a janela craniana com um laser de 561 nm para garantir a injeção adequada da solução. Nota: Rosa Bengala será visualizada dentro de 5 segundos após a injeção na vasculatura do cérebro. Todo o vaso deve ser preenchido com Rosa Bengala.
3. Após a injeção adequada de corante Rose Bengal, escolha um vaso apropriado para trombose com base no diâmetro do vaso (40-80 μm) para garantir a reprodutibilidade de um determinado volume de lesão. Diferencie entre artérias e veias observando a direção do fluxo sanguíneo: as artérias se moverão de vasos de diâmetro maior para vasos de diâmetro menor, veias se movem de vasos de diâmetro menor para vasos de diâmetro maior. Isso é facilmente realizado pela visualização, uma vez que Rose Bengal é injetado.
4. Altere a configuração do microscópio da seguinte forma:
   1. Aumente o tempo de permanência. Observação: Isso varia de acordo com o sistema de microscópio utilizado.
   2. Aumente a potência do laser para 100%.
   3. Colete imagens de sequência de tempo a 1 quadro/s usando a velocidade máxima de digitalização.
5. Examine o mouse até que um coágulo estável seja formado dentro do vaso. Nota: Isso normalmente é obtido dentro de 5 minutos de varredura contínua (consulte Figura 4).
6. Após a indução da formação de coágulos usando Rose Bengal, remova o camundongo da área de imagem de volta ao microscópio de dissecação. Remova cuidadosamente o anel de aço inoxidável do crânio craniano. Examine a janela craniana em busca de sangramento. Se ocorrer sangramento, encerre o experimento.
7. Use sutura de monofilamento 6.0 para fechar a incisão sobre o crânio. Coloque pomada antibiótica ao longo da linha de sutura para evitar infecções. Injete Buprenex (0,05 mg / kg) por via subcutânea a cada 12 horas por três dias para controle da dor.
8. Retorne o mouse a uma câmara de recuperação após a remoção do anestésico até que esteja totalmente acordado e se movendo livremente.
9. Retorne o mouse a uma gaiola limpa para uma investigação mais aprofundada posteriormente.

Resultados

Figura 1: Anel de aço inoxidável. Três vistas (superior, lateral e inferior) são mostradas do suporte do anel de aço inoxidável que é aplicado ao crânio do mouse para fixá-lo ao suporte estereotáxico.

Materiais