Modelagem da regeneração sensorial do axônio em um rato usando injeção do gânglio da raiz dorsal e lesão por esmagamento da raiz dorsal

Resumo

Fonte: Cheah, M., et al. Injeção do gânglio da raiz dorsal e lesão por esmagamento da raiz dorsal como modelo para regeneração sensorial do axônio. J. Vis. Exp. (2017).

Este vídeo demonstra um procedimento passo a passo para injetar uma suspensão viral nos gânglios da raiz dorsal (DRGs) e induzir uma lesão axonal controlada por meio de um esmagamento da raiz dorsal em um rato anestesiado. O protocolo envolve a exposição dos DRGs, a entrega de um vetor viral promotor de crescimento para facilitar a regeneração axonal e o corte das conexões axonais com a medula espinhal para modelar a lesão e regeneração do nervo sensorial.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Injeção de DRG e realização de uma lesão por esmagamento da raiz dorsal

NOTA: Esta é uma cirurgia extremamente delicada. É aconselhável praticar em alguns animais mortos primeiro para se familiarizar com a anatomia antes de avançar para a cirurgia de animais vivos.

1. Localize os processos espinhosos C2 e T2 proeminentes sobre a pele. Faça uma incisão na pele entre os processos espinhosos C2 e T2 com uma lâmina de bisturi nº 10 (uma vez que a pele é aberta, uma linha média branca de tecido fibroso deve ser visível na primeira camada de músculo; a primeira camada de músculo tem uma textura "gelatinosa").
2. Faça uma incisão de tamanho semelhante na primeira camada de músculo ao longo da linha média branca usando uma lâmina de bisturi. Não vá além do processo espinhoso proeminente em T2, pois há um ramo arterial importante da aorta descendente localizado próximo a ela.
   NOTA: Sangramento intenso pode ocorrer em qualquer lugar a partir desta etapa. Sempre pare o sangramento e remova o sangue usando cotonetes esterilizados ou esponjas cirúrgicas absorvíveis para permitir uma visualização clara em todos os momentos. Prosseguir com o procedimento "às cegas" pode resultar em danos indesejados à medula espinhal, DRG ou raiz dorsal, levando a efeitos adversos inesperados no animal posteriormente.
3. Retraia a primeira camada de músculo usando dois afastadores, um colocado rostralmente e outro caudalmente; A segunda camada de músculo, com aparência estriada, deve ser visível.
4. Localize a linha média da segunda camada de músculo (onde dois músculos longitudinais podem ser observados conectados por um tecido fino e membranoso). Disseque o tecido membranoso usando uma microtesoura para separar os dois músculos longitudinais. Evite usar uma lâmina de bisturi, se possível, pois isso pode resultar em danos musculares desnecessários e sangramento.
5. Ajuste os afastadores de acordo para expor a terceira camada de músculo fino que cobre a coluna. Os processos espinhosos podem ser sentidos tocando levemente com uma pinça sobre a terceira camada do músculo.
6. Faça uma pequena incisão na terceira camada de músculo usando uma microtesoura e raspe suavemente o músculo do osso usando uma cureta ou bisturi de lado para expor claramente as vértebras. Se necessário, corte parte do músculo ou tendão para facilitar a laminectomia.
7. Para expor os DRGs C5 - C8 esquerdos, execute uma hemilaminectomia esquerda nas vértebras C4 - T1 removendo cuidadosamente parte da lâmina e do pedículo usando um par de rongeurs finos. O DRG está localizado próximo ao forame transverso das vértebras.
   NOTA: As vértebras C3 - C7 não têm um processo espinhoso proeminente. O DRG C5 está localizado entre as vértebras C4 e C5, o DRG C6 está entre as vértebras C5 e C6 e assim por diante, enquanto o DRG C8 está entre as vértebras C7 e T1. Não há vértebra C8, apesar da presença de um DRG C8 e um segmento medular C8.
8. Depois que uma quantidade suficiente de DRG tiver sido exposta para injeção, prepare a seringa colocando a seringa de microlitro cheia de vírus equipada com uma agulha romba de calibre 33 feita sob medida no suporte da seringa estereotáxica. Antes da injeção, use uma agulha chanfrada de calibre 30 para fazer uma pequena abertura superficial em cada um dos DRG direcionados para auxiliar na inserção da agulha de injeção.
9. Insira a agulha de calibre 33 no centro do DRG girando os botões suavemente para ajustar as coordenadas estereotáxicas. Não insira demais a agulha, pois isso pode causar vazamento de fluido do lado ventral do DRG. Caso ocorra vazamento, ajuste a posição da agulha imediatamente.
   NOTA: As coordenadas estereotáxicas numéricas não são usadas; no entanto, é útil utilizar a armação para segurar a agulha para injeção.
10. Injete 1 μL do vírus em cada DRG a 0,2 μL / min usando uma bomba de seringa de infusão. Aguarde mais três minutos antes de retirar a agulha. Durante a injeção, o DRG mudará lentamente de cor se a solução do vírus contiver um corante colorido.
11. Para realizar uma lesão simultânea por esmagamento da raiz dorsal C5 - C8, esmague cada raiz três vezes por 10 s cada usando um par de pinças de ponta fina (Bonn Micro), opondo-se completamente às extremidades da pinça; Uma linha branca no tecido deve aparecer no local do esmagamento. Não vá mais fundo do que o necessário com a pinça, pois isso pode causar danos à raiz ventral.

Materiais

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