Avaliando a integridade da barreira hematoencefálica em um modelo de rato com lesão cerebral induzida por laser

Resumo

Fonte: Kuts, R. et al. Lesão cerebral induzida por laser no córtex motor de ratos. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demonstra a avaliação da integridade da barreira hematoencefálica (BHE) após lesão cerebral induzida por laser em ratos. Um corante de rastreamento é injetado na veia da cauda, permitindo que ele circule para o cérebro e vaze para o tecido através do BBB danificado. O cérebro é então extraído e processado para liberar o corante. A intensidade de fluorescência do corante é medida para quantificar a extensão do dano BBB induzido pelo laser.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Procedimento

1. experimental de lesão cerebral induzida por laserAtribua 20 ratos a um grupo marcado como grupo de laser e 20 ratos a outro grupo de controle (operado de forma simulada).
2. Submeter os ratos do grupo laser à irradiação laser a 50J X 10 pontos da seguinte maneira:
   1. Anestesiar rato com uma mistura de 2% de isoflurano em oxigênio permitindo ventilação espontânea. Verifique se há profundidade anestésica suficiente beliscando a cauda com uma pinça para ver a ausência do reflexo de retirada.
   2. Manter a temperatura corporal central do rato a 37 °C durante todo o procedimento experimental usando uma almofada de aquecimento regulada por temperatura retal.
   3. Remova os pelos locais com um barbeador e desinfete com álcool 70% e gluconato de clorexidina a 0,5%. Repita a etapa de desinfecção mais duas vezes.
      NOTA: O tamanho da incisão cirúrgica deve ser de aproximadamente 3 cm. Remova o cabelo pelo menos 2 cm ao redor da área da incisão.
   4. Coloque o rato em um suporte de cabeça estereotáxico em decúbito ventral e faça uma incisão de 3 cm para refletir o couro cabeludo lateralmente e expor a área entre Bregma e Lambda.
   5. Mantenha a anestesia através do cone do nariz.
   6. Use laser de granada de ítrio-alumínio dopado com neodímio (Nd-YAG) (comprimento de onda de pico de 1064 nm) para administrar 50J X 10 pontos, com duração de pulso de 1 s, na área exposta do crânio acima do hemisfério direito.
   7. Certifique-se de que a parte geradora de laser do aparelho esteja a uma distância de 2 mm da área exposta para produzir um feixe de laser. 50pontos J X 10 foram selecionados após avaliação cuidadosa de diferentes combinações de energia/superfície. Esta combinação é eficiente e não causa destruição óssea do crânio após administração por menos de um segundo.
      NOTA: 2 mm é a distância entre o terminal do feixe de laser (do cabo óptico pelo qual ele passa) e o osso do crânio. Caso seja utilizada uma lente de foco, a distância deve ser calculada considerando o ângulo de inclinação da lente para focar o feixe na área de dano desejada. Garanta a segurança adequada ao usar um dispositivo a laser, incluindo treinamento adequado e proteção para os olhos.
   8. Remova o rato do dispositivo e feche o couro cabeludo com suturas cirúrgicas de seda 3-0.
   9. Interrompa a anestesia e devolva o rato à sua gaiola para recuperação. Administre 0,1 mL de bupivacaína a 0,25% localmente para reduzir a dor pós-operatória imediatamente após a cirurgia.
      NOTA: Todo o procedimento deve durar menos de 5 min se executado corretamente.
3. Observe o rato em busca de sinais de angústia durante a recuperação pós-anestésica. Antes de sair da anestesia, administre buprenorfina intramuscular 0,01 mg / kg para analgesia pós-operatória e continue com doses repetidas a cada 12 h por pelo menos 48 h.
4. Sujeito controla ratos às mesmas condições sem submetê-los ao laser.

2. Pontuação de gravidade neurológica (NSS)

1. Avalie a pontuação de gravidade neurológica 24 h após a lesão cerebral induzida por laser usando uma pontuação de 43 pontos. Teste os animais quanto a déficits neurológicos, distúrbios de comportamento, tarefa de equilíbrio de feixe e reflexos, atribuindo pontuações mais altas para deficiências mais graves.

3. Avaliação da lesão

1. cerebralDeterminando a extensão da quebra da barreira hematoencefálica (BBB)
   NOTA: Avalie a quebra da BBB 24 h após a lesão cerebral induzida pelo laser da seguinte forma:
   1. Administre 2% de Evans Blue misturado com 4 mL/kg de solução salina por via intravenosa a ratos através da veia da cauda canulada e deixe a solução circular por 1 h.
   2. Eutanasiar ratos expondo-os a 20% de oxigênio e 80% de CO₂ (via inspiração) 24 h após o último NSS.
   3. Colha o corante localizado intravascularmente da seguinte forma:
      1. Abra o peito dos ratos com pincettes cirúrgicos e tesouras cirúrgicas.
      2. Perfundir os animais com soro fisiológico 0,9% resfriado via ventrículo esquerdo utilizando 110 mmHg até obter um líquido de perfusão incolor do átrio direito.
   4. Colha os miolos e corte-os rostro-caudalmente em fatias de 2 mm.
   5. Separe as fatias do cérebro esquerdo das partes direitas para avaliar os hemisférios lesionados e não lesionados separadamente.
   6. Pese, homogeneize usando almofariz e pilão e, em seguida, incube os tecidos cerebrais em ácido tricloroacético a 50% por 24 h.
   7. Centrifugue as fatias homogeneizadas do cérebro a 10.000 × g por 20 min.
   8. Misture 1 mL do sobrenadante do cérebro centrifugado com 1,5 mL de etanol a 96% a 1:3 e avalie a quebra da barreira hematoencefálica usando um detector de fluorescência no comprimento de onda de excitação de 620 nm (largura de banda de 10 nm) e comprimento de onda de emissão de 680 nm (largura de banda de 10 nm).
      NOTA: Ambos os grupos de ratos passam pelo mesmo protocolo para determinar a quebra da BBB.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
50% ácido tricloroacético	SIGMA - ALDRICH	76-03-9
Matrizes de Cérebro & Tecido	SIGMA - ALDRICH	15013
Cânula Venflon 22 G	KD-FIX	1.84E+11
Centrífuga Sigma 2-16P	SIGMA - ALDRICH	Sigma 2-16P
Balanças Analíticas Compactas	SIGMA - ALDRICH	HR-AZ/HR-A
Balança Digital	SIGMA - ALDRICH	Rs 4.000
Tesoura de dissecação	SIGMA - ALDRICH	Z265969
Pipeta Eppendorf	SIGMA - ALDRICH	Z683884
Eppendorf Tube	SIGMA - ALDRICH	EP0030119460
Etanol 96%	ROMICAL		Líquido
Evans Blue 2%	SIGMA - ALDRICH	314-13-6
Detector de fluorescência	Tecan, Männedorf Suíça	modelo Infinite 200 PRO leitor
Aquecedor com termômetro	Heatingpad-1	Modelo: HEATINGPAD-1/2
Infusion Cuff	ABN	IC-500
Isofluran, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc	NDC 66794-017
Multiset	TEVA MEDICAL	998702
Microscópio Olympus BX 40	Olympus
Placas de Petri	SIGMA - ALDRICH	P5606
Lâminas de bisturi 11	SIGMA - ALDRICH	S2771
Sharplan 3000 Nd:YAG (granada de ítrio e alumínio dopado com neodímio)	máquina a laser Laser Industries Ltd
Suporte de cabeça estereotáxico	KOPF	900LS
Seringa Estéril 2 ml	Braun	4606027V
Agulha de seringa 27 G	Braun	305620

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