Localização de fluorescência de proteínas de junção apertada e fibras de estresse em células endoteliais

Resumo

Fonte: Alluri, H., et al. Privação e reoxigenação de oxigênio-glicose como um modelo de lesão de isquemia-reperfusão in vitro para estudar a disfunção da barreira hematoencefálica. J. Vis. Exp. (2015).

O vídeo demonstra a localização fluorescente de proteínas de junção apertada e fibras de estresse em células endoteliais microvasculares do cérebro de ratos (RBMECs). Na monocamada estressada, anticorpos marcados com fluorescência são usados para marcar as proteínas de junção apertada, enquanto a faloidina marcada com fluoróforo marca as fibras de estresse. As moléculas marcadas são então visualizadas por meio de microscopia confocal.

Protocolo

1. Semeadura de células endoteliais

1. Obter culturas primárias de RBMECs de ratos Sprague Dawley adultos (ou obtê-las comercialmente).
2. Cultive RBMECs em placas de Petri revestidas com fibronectina (50 μg / ml) de 100 cm usando o meio de crescimento de células endoteliais do cérebro de rato. Troque o meio a cada dois dias, até que a confluência seja alcançada.
3. Ao atingir 80-90% de confluência, lave suavemente as células em 5 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) girando. As células são então destacadas expondo-as a 1 ml de solução quente de ácido tripsina etilenodiaminotetracético (EDTA) a 0,25%, equilibrada a 37 °C.
4. Incube as células a 37 °C por 2-5 min até que as células estejam separadas e dispersas.
   NOTE: Bata na placa de cultura para separar as células. View células ao microscópio para confirmar o desprendimento completo das células da superfície do prato.
5. Adicione 5 ml de meio completo à placa de Petri para neutralizar a tripsina. Pipetar o meio que contém as células destacadas e recolhê-lo para um tubo de centrifugação de 15 ml.
6. Centrifugue o meio contendo células endoteliais a 220 x g por 5 min.
7. Aspirar o sobrenadante e preservar as células que contêm o sedimento. Suspenda o pellet em 3-5 ml de meio de crescimento de células endoteliais frescas do cérebro de rato, misturando-o suavemente para cima e para baixo com uma pipeta. As células serão então contadas usando um contador de células automatizado ou um hemocitômetro.
8. Transfira a suspensão celular para fibronectina (50 μg/ml) sistema de lâminas de câmara estéril de 8 poços pré-revestido, estilo < vão de 0,7 cm='família de fontes:Arial,sans-serif;tamanho da fonte:0,6em;estilo da fonte:normal;variante da fonte:normal;peso da fonte:400;decoração de texto:nenhum;alinhamento vertical:linha de base;espaço em branco:pré-embrulho;'>²/poço com uma densidade de semeadura variando entre 10.000-15.000 células por poço. Aumente as células a 37 °C até que a confluência seja alcançada
   NOTA:<span style='font-family:Arial,sans-serif; tamanho da fonte:12pt; estilo da fonte:normal; variante de fonte: normal; peso da fonte: 400; decoração de texto:nenhuma; alinhamento vertical:linha de base; espaço em branco: pré-encapsulamento;' > Para a realização de western blots ou outros experimentos, as células podem ser cultivadas em placas de cultura de células de 10 cm ou placas especiais, conforme exigido pelo experimento.

2. Privação-Reoxigenação de Oxigênio e Glicose (OGD-R) In vitro Model

1. Use o sistema de cultura de células de hipóxia para estudar os efeitos do OGD-R em RBMECs em (consulte Figura 1). Configure e calibre o sistema de cultura de células de hipóxia antes de iniciar o experimento, de acordo com as instruções do fabricante.
2. Remova as lâminas da câmara confluente (etapa 1.8) da incubadora a 37 °C. Substitua o meio completo na lâmina da câmara por meio de Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco, desoxigenado, sem glicose e colocado na câmara de hipóxia por 95%, N₂ e 5% CO₂ por 2 h a 37 °C, para representar a condição OGD.
3. Mova as células de volta para a incubadora com 95% O₂, 5% CO₂ a 37 ° C e fornecido com células endoteliais endoteliais frescas do cérebro de rato em meio completo e incubar por mais 1 hora a 37 ° C.
   NOTA: Esta etapa representa uma situação de reoxigenação.
4. Use as lâminas da câmara para localização de imunofluorescência e marcação de faloidina rodamina (consulte a seção 3).

3. Localização de imunofluorescência de zonula occludens-1 (ZO-1) e actina filamentosa (f-actin) Rotulagem usando rolamina faloidina

1. Exponha as lâminas da câmara contendo monocamadas RBMEC a 100 μl de opti-MEM/meio de soro reduzido/poço por 1 hora. Lave as lâminas da câmara 3 vezes em 100 μl de solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,0-7,2).
2. Fixe as células usando 100 μl de paraformaldeído a 4% em PBS (pH 7,0-7,2) por 15 min e lave as lâminas da câmara por mais 3 vezes em PBS (pH 7,0-7,2).
3. Permeabilize as células usando 100 μl de Triton X-100 a 0,5% em PBS (pH 7,0-7,2) por mais 15 min. Bloquear com 100 μl de albumina sérica bovina a 2% (BSA) em PBS por uma hora. Após esta etapa, core/rotule as células para ZO-1 ou f-actin.
   1. Para coloração de imunofluorescência, incube as células com um anticorpo primário anti-coelho contra ZO-1 em 1:150, preparado em 2% BSA-PBS para durante a noite (O/N) a 4 °C. Lave as células 3 vezes em PBS (pH 7,0-7,2). Incubar com 100 μl de anticorpo secundário anti-coelho marcado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) por 1 hora à temperatura ambiente (RT).
   2. Para marcação de Rodamina Faloidina, após o bloqueio, exponha as células a 100 μl de rodamina faloidina em diluição 1:50, preparada em 2% BSA-PBS, por 20 min.
   3. Lave as células da coloração de imunofluorescência e marcação de rodamina faloidina em PBS, (pH 7,0-7,2). Monte as câmaras usando meios de montagem contendo reagente antidesbotamento com 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI).
4. Visualize as células usando uma lente de imersão em água 60 X e as células são digitalizadas em um único plano óptico sob um microscópio confocal.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Proox model 110	Biospherix	Model 110
DMEM, sem glicose	Gibco, Life technologies	11966-025
Rhodamine Phalloidin	Life technologies	R415
ZO-1 Anticorpo Policlonal para Coelho	Life technologies	617300
Nunc Lab Tek II-CC 8 lâminas de vidro estéreis de 8 poços	Thermo scientific	177402
secundário anti-coelho marcado com FITC anticorpo	Santa cruz	sc-2090
DPBS 1X	Thermo scientific	SH 30028.03	Qualquer outro PBS disponível pode ser usado