Um modelo mínimo de lesão medular para estudar a ativação e migração de células-tronco neurais

Resumo

Fonte: Lakshman, N., et al. Um ensaio de neuroesfera para avaliar a ativação endógena de células-tronco neurais em um modelo de camundongo com lesão mínima da medula espinhal. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo demonstra a ativação e migração de células-tronco neurais (NSCs) em um modelo de lesão medular de camundongo. Para expor a medula espinhal, uma vértebra da região torácica da coluna vertebral é removida de um camundongo anestesiado. Uma lesão superficial é então criada na substância branca da medula espinhal usando uma agulha dobrada, que preserva o canal central. Após a lesão, os NSCs ao redor do canal são ativados e migram para o local da lesão para auxiliar no reparo tecidual.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Cirurgia de lesão medular mínima

NOTA: Antes da cirurgia, certifique-se de que todos os instrumentos e materiais cirúrgicos sejam esterilizados por métodos apropriados (Figura 1A).

1. Construa um arco de suporte torácico enrolando 4 a 5 quadrados de gaze e prendendo-os no meio para obter um rolo fixo de gaze.
2. Coloque o camundongo na câmara de indução e inicie a anestesia com isoflurano a 5%. Confirme a ausência de reflexo de pinça do dedo do pé antes de prosseguir, bem como durante todo o procedimento. Como a cirurgia pode levar mais de 30 minutos para ser concluída, otimize para a exposição mínima ao isoflurano (5 minutos a 5% e o tempo restante a 2–3%).
3. Transfira o camundongo para um cone nasal conectado à máquina anestésica na dose de manutenção de isoflurano a 2–3%. Use uma máquina de cortar cabelo para remover o pelo do dorso do animal do meio das costas até o pescoço/orelhas para expor uma ampla área retangular da pele para cirurgia.
4. Transfira o mouse para um instrumento estereotáxico, colocando o nariz no cone do nariz anexado e estabilizando o crânio com barras auriculares. Mantenha o isoflurano a 5% durante a colocação das barras auriculares e abaixe as costas para 2–3% quando o mouse estiver preso no dispositivo estereotáxico.
5. Administre medicamentos analgésicos pré-operatórios por via intraperitoneal - Meloxicam (2,0 mg / kg). Aplique generosamente lubrificação ocular nos olhos abertos do camundongo para evitar a dessecação da córnea quando estiver sob anestesia.
6. Coloque o arco de suporte torácico embaixo do abdômen do camundongo enquanto endireita o corpo e a coluna do camundongo puxando levemente a base da cauda. Use fita adesiva de laboratório para prender a cauda e todos os membros estendidos em uma posição de estrela. Uma vez seguro, empurre o arco de suporte torácico rostralmente, do abdômen do camundongo em direção à parte superior do tórax - a fim de sustentar a coluna torácica (Figura 1B).
7. Prepare um campo cirúrgico estéril desinfetando a área da pele cortada pelo preparada na etapa 1.3 com etanol a 70%, seguido de iodopovidona. Repita duas vezes. Aplique uma cortina cirúrgica estéril para manter um amplo campo estéril.
8. Usando uma lâmina de bisturi #10, faça uma incisão vertical paralela ao eixo longitudinal do animal do ponto médio de ambas as omoplatas até a curvatura da coluna torácica. Retraia a pele para expor o tecido mole e o contorno da coluna vertebral (Figura 1C).
9. Identifique a borda inferior do coxim adiposo supraescapular (isso demarca o nível vertebral T4/5). Com a mesma lâmina # 10, com cuidado, mas com força, corte ao longo de ambos os lados do osso vertebral T5–T8/9 para separar os tendões do músculo dorsal da coluna.
10. Insira os dentes dos afastadores nos locais de incisão em ambos os lados da coluna. Ajuste a exposição expandindo os afastadores para elevar suficientemente a coluna sem colocar muita pressão nas camadas musculares retraídas (Figura 1D).
11. Sob o microscópio cirúrgico, limpe cuidadosamente o músculo residual e outros tecidos moles que recobrem a coluna vertebral para expor o osso vertebral (Figura 1E). Identifique as vértebras que serão removidas apertando o processo espinhoso das vértebras com uma pinça dentada e movendo-o ligeiramente para cima e para baixo.
    NOTA: Isso deve permitir a identificação das articulações intervertebrais e expor as pequenas aberturas (forames intervertebrais) sob as vértebras de interesse.
12. Insira uma cabeça da tesoura curva embotada em cada lado do forame intervertebral exposto, caudal à lâmina vertebral a ser excisada, e corte as articulações intervertebrais conectadas bilateralmente.
13. Levante a lâmina para cima e corte a fixação superior da lâmina para isolar e remover o osso.
    NOTA: Isso exporá o saco dural intacto contendo a medula espinhal (Figura 1F). Pode haver sangramento excessivo que pode ser controlado colocando gaze pré-cortada de 1 cm x 1 cm nas áreas afetadas e/ou lavando com solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS).
14. Com a veia da linha média dorsal servindo como ponto de referência, insira uma haste dobrada de 45° de uma ponta de agulha de 30 G (com o chanfro da agulha voltado para cima) na superfície dorsolateral da medula espinhal (aproximadamente 1 mm de profundidade) a aproximadamente 0,5 mm lateral de cada lado da linha média.
15. Mova a agulha ~2 mm de caudal para rostral (paralelo à linha média) de modo que todo o comprimento do chanfro da agulha seja inserido no cordão. Remova a agulha refazendo o caminho de entrada (Figura 1G).
    NOTA: Não deve haver sangramento, mas pode ser observado inchaço do tecido espinhal nesta etapa.
16. Para fechar a ferida, remova o afastador e suture os músculos das costas de cada lado da lesão juntos na linha média usando uma sutura absorvível 6-0. Use uma sutura de seda estéril 4-0 para fechar posteriormente a pele sobrejacente.

Resultados

Figura 1: Procedimento cirúrgico. (A) O layout de tudo o que é necessário, numerado para referência. (B) Uma imagem do rato em um dispositivo estereotáxico com um corpo endireitado, coluna e membros espalhados e colados junto com o arco de suporte torácico colocado embaixo. (C) Uma imagem do camundongo com uma incisão vertical na pele expondo a camada...

Materiais

< classe de figura='tabela' estilo='largura::1010pt;'> embotadastd style='width:149pt;'>Fine Science Tools apropriadode cuidados com animais apropriado de drogas da pele muscular

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agricola Retractor	Fine Science Tools	17005-04
Moria Tesouras de mola Vannas-Wolff (curvas)	Fine Science Tools	15370-50	Personalize ao fazer o pedido para obter pontas
Graefe Forceps (Straight, 1x2 Teeth)<	11053-10
Pinça Graefe Extra Fina (Curva, Serrilhada)	Fine Science Tools	11152-10	Ou qualquer outra pinça para sutura
Hartman Hemostats (Straight)	Fine Science Tools	13002-10	Ou qualquer outro apropriado para sutura
Scalpel Handle #3	Fine Science Tools	10003-12	Ou qualquer outro apropriado
Hair clippers	amazon.ca	https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA	ou qualquer outro apropriado
Stereotaxic instrument	Stoeling	51500	ou qualquer outro
Meloxicam			ou qualquer sancionado apropriado por uma instalação
Tears Naturale P.M.	Alcon	https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE	ou qualquer outro
Isoflurano	Baxter International Inc	DIN 02225875	ou qualquer outro apropriado para anestesia
Cotonetes Cottom da Q-tip	amazon.ca	https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS
Cotton Gauze	Fisher Scientific	13-761-52
30G Needles	Becton Dickinson	305106	For Injury
25G Needles	Becton Dickinson	305122	For Drug injections
1mL Seringas	Becton Dickinson	3090659	para injeções
3mL Seringas	Becton Dickinson	309657	for fluid injections
4-0 Sutura	uoftmedstore.com	2297-VS881	para sutura
6-0 Sutura	uoftmedstore.com	VS889	para sutura
Ferramentas de dissecação padrão	Fine Science Tools
Dissection Microscope	Zeiss	Stemi 2000