Realização de imuno-histoquímica em tecido cerebral de primatas não humanos

Resumo

Fonte: Eid, L. & Parent, M. Preparação de tecido cerebral de primatas não humanos para imuno-histoquímica pré-incorporação e microscopia eletrônica. J. Vis. Exp. (2017).

Este vídeo demonstra a preparação de tecido cerebral de primatas não humanos fixado em aldeído usando imuno-histoquímica pré-incorporada para microscopia eletrônica. Ele descreve as etapas para imunomarcar uma proteína neuronal específica, seguida por uma reação de peroxidase que produz um precipitado colorido, permitindo a visualização da proteína alvo na microscopia eletrônica.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Imuno-histoquímica pré-incorporada (Figura 1C)

1. Prepare uma solução-mãe de 4 L de solução salina tamponada com Tris (TBS, 50 mM, pH 7,6) da seguinte forma.
   1. Meça 2L de água destilada em um copo de 4 L, adicione 24,23 g de trihidroximetil aminometano (THAM; C₄H₁₁NÃO₃), e mexa para dissolver.
   2. Ajuste o pH para 7,6 com aproximadamente 148 mL de HCl 1 N. O ácido deve ser adicionado com cautela para evitar atingir um pH abaixo de 7,6. O volume total deve ser de 4 L.
      CUIDADO: O HCl é altamente corrosivo. Use o EPI apropriado.
2. Selecione as seções contendo a região de interesse a ser processada para imuno-histoquímica EM.
3. Lave as seções flutuantes 3x em PBS (0.1 M, pH 7.4) por 5 min em RT para enxaguar a solução anticongelante.
4. Prepare uma solução a 0,5% de NaBH₄ diluída em PBS.
   1. Pesar 0,05 g de NaBH₄ e diluir em 10 mL de PBS. Não cubra. Prepare esta solução imediatamente antes de usar.
5. Incubar as secções na solução de NaBH₄ recém-preparada durante 30 min a RT. Agitar suavemente. Não cubra.
6. Lave 3x em PBS por 10 min em RT, balançando vigorosamente até que nenhum gás de reação permaneça.
7. Prepare uma solução de bloqueio para EM com 2% de soro normal apropriado e 0,5% de gelatina de peixe fria diluída em PBS.
   NOTA: A quantidade deve ser calculada para ter o suficiente para as três etapas a seguir. Use um soro feito da mesma espécie animal que hospeda o anticorpo secundário. Evite o uso de métodos de recuperação de antígenos ou a adição de pequenas quantidades de triton (para aumentar a penetração de anticorpos), pois esses métodos comprometem significativamente a qualidade do tecido.
8. Incubar as secções na solução de bloqueio durante 1 h a RT. Agitar suavemente.
9. Prepare a solução primária de anticorpos diluída na solução de bloqueio.
   NOTA: A concentração do anticorpo primário é geralmente a mesma da imuno-histoquímica do LM, mas considere a realização de testes com diferentes concentrações de anticorpos de antemão, pois alguns anticorpos primários podem não funcionar com a acroleína. Nesse caso, é possível usar uma mistura de glutaraldeído (0,1 - 2%) e 4% de PFA para perfusão transcardíaca e obter resultados semelhantes. Otimize também o tempo e a temperatura de incubação.
10. Incubar as secções em solução de anticorpos primários durante a noite em RT com um balanço suave. Use um tempo e temperatura de incubação previamente testados.
11. Lave as seções 3x em PBS por 5 min em RT com um balanço suave.
12. Prepare uma solução 1:1.000 de anticorpo secundário biotinilado diluído na solução de bloqueio.
    NOTA: O anticorpo secundário deve ser levantado contra a espécie hospedeira usada para gerar o anticorpo primário.
13. Incubar as secções numa solução de anticorpos secundários durante 1,5 h a RT.
14. Preparar uma solução de avidina-biotina-peroxidase (ABC) pelo menos 60 minutos antes do final da incubação do anticorpo secundário.
    1. Use uma pipeta calibrada para medir 8,80 μL / mL das soluções A e B e dilua-as em PBS.
    2. Balance levemente por pelo menos 60 min em RT para permitir a ligação completa entre as moléculas de avidina e biotina.
15. Após a incubação na solução de anticorpos secundários, lave 3x em PBS por 10 min em RT.
16. Incube as seções na solução ABC por 1 h em RT.
17. Lave uma vez em PBS e duas vezes em TBS por 10 min em RT com um balanço suave.
18. Prepare uma solução fresca de 3,3'-diaminobenzidina (DAB) a 0,05% com 0,005% de H₂O₂ diluído em TBS.
    1. Pesar 12,5 mg de DAB e diluí-lo em 25 mL de TBS frio. Proteger da luz.
       CUIDADO: O pó DAB é altamente volátil e prejudicial se inalado. É cancerígeno e teratogênico. Assim, mulheres grávidas ou amamentando não devem manipular este produto, mesmo quando diluído. Use uma máscara N95 ao manipular e use EPI.
    2. Filtrar a solução e adicionar 4,5 μL de H₂O₂ a 30% imediatamente antes da utilização.
19. Incube seções na solução DAB por 3 a 7 min em RT.
    NOTA: O precipitado marrom não deve ser muito escuro para evitar um alto nível de coloração de fundo. O tempo de incubação deve ser otimizado de acordo.
20. Pare a reação lavando rapidamente duas vezes em TBS frio, depois duas vezes por 10 min em TBS frio em RT, seguido de duas vezes por 10 min em PB, com balanço leve.
    NOTA: O uso de PB (e não PBS) é fundamental para eliminar quaisquer vestígios de NaCl, pois ele reagiria com o ósmio e formaria cristais.

Resultados

Figura 1: Esquemas das etapas essenciais do protocolo. O cérebro do macaco (A) é cortado em seções seriais com um vibratomo de resfriamento (B). Em seguida, é pr...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Dibasic anidro sodium	Fisher scientific	S374-500
Monobasic monohydrate	EM Science	SX0710-1
Cloreto de sódio (NaCl)	Fisher scientific	S271-3
Hydroxymethyl aminomethane (THAM)<	T370-500
HCl	EMD	HX0603-3	1N diluição. O produto é corrosivo. Use com a proteção apropriada.
NaOH	EMD	SX0590-1	5N diluição. O produto é corrosivo. Use com proteção adequada.
Paraformaldeído	Sigma	P6148	4% de diluição. O produto é altamente volátil em sua forma de pó e altamente tóxico. Use com cuidado sob um exaustor com proteção adequada.
Acrolein (90%)<	110221	3% de diluição. O produto é altamente tóxico. Use sob um capuz de ventilação com proteção adequada.
Tabela de ventilação de autópsia	Mopec	CE400
Electronic perfusion pump	cole parmer	masterflex L/S 7523-90<
Needle (perfusion)	terumo	NN-1838R	18G 1 1/2
Agulha	terumo	NN-2713R	21G 1/2
Ketamine			20 mg/kg
Xylazine			4 mg/kg
Acepromazine			0,5 mg/kg
Scalpel
Lâminas de bisturi<	201011 J9913	No.22 para cirurgia e No. 11 para EM
Surgical scissors
Rongeurs
Vibratome	Leica	VT 1200S	Calibre a lâmina antes de cada uso, quando o dispositivo permitir
Vibratome razor blade	Gillette	GIN 642107
Glycerol	Fisher scientific	G33-4	30% de diluição
Ethylene glycol	Fisher scientific	E178-4	30% de diluição
Sodium borohydride	sigma	S-9125
Normal horse serum	Jackson immunoResearch Laboratories	008-000-121	2% dilution
Gelatina de peixe frio	Aurion	900.033	0,5% de diluição. O produto original está concentrado em 40%
Primary antibody, SERT	Santa Cruz biotechnology	SC-1458	1/500 dilution
Primary antibody, ChAT	Chemicon (Millipore)	AB144P	1/25 diluição
Primary antibody, TH	ImmunoStar	22941	1/1000 dilution
Anticorpo secundário biotinilado, cabra	Vector laboratories	BA-9500	1/1000 diluição
Biotinylated secondary antibody, mouse	Vector laboratories	BA-2000	1/1000 dilution
Vectastain elite ABC kit	Vector laboratories	PK6100	8,8 μL/mL de A e B cada
3'3 diaminobenzidina (DAB)	Sigma	D5637	0,05% de diluição. O produto é altamente volátil em sua forma de pó e tóxico. Não jogue lixo na pia.
Peróxido 30%	Fisher scientific	H-323	0,005% de diluição

phosphate sodium phosphate td style='border-bottom:1px sólido #000000;border-right:1px sólido #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>Fisher scientifictd style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>sigmatd style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'> td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>Lança de penas